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肝纤维化（Hepatic fibrosis,HF）是指肝脏内弥漫性细胞外基质（特别是胶原）的过度沉积,是机体应答各种慢性刺激,形成损伤与抗损伤反复演变的过程,是各种慢性肝病走向肝硬化的必由之路。肝纤维化的形成是由于细胞外基质的合成与降解的平衡失调所致,在这个过程中,肝星状细胞（HSC）是产生细胞外基质的主要细胞,其活化是肝纤维化产生的最关键步骤,各种因素引起HSC的活化、增殖以及细胞外基质的沉积是肝纤维化形成的两个重要环节。水飞蓟素（silymarin,SL）是从水飞蓟种子中提取精制而得到的类黄酮混合物,其中水飞蓟宾含量最多、活性最高、药理作用最强,但由于水飞蓟宾难溶于水、口服吸收差、生物利用度低,影响其临床应用。为此,国内外积极开发研制其新剂型,本次实验的药品正是基于新型给药系统（NDDS）做成的长效靶向制剂,以乳酸-羟基乙酸共聚物[poly（lactic-co-glycolic acid）,PLGA]为载体,选用高分子材料,制成水飞蓟宾PLGA肝靶向长效微球冻干制剂,不但能够肝靶向定位给药,还可以长时间缓慢释放,解决了肝病患者日一次给药的困扰。本研究采用四氯化碳（CCl4）加酒精的复合方法制备大鼠肝纤维化模型,选择水飞蓟宾微球50mg/kg组、25mg/kg组和12.5mg/kg组、水飞蓟宾葡甲胺注射剂（25mg/kg）组以及水飞蓟宾胶囊（25mg/kg）组等,从肝功能、肝脏组织形态和细胞外基质代谢等角度观察了水飞蓟宾微球粉针剂作为肝靶向制剂的长效缓释效果。造模方法:除正常组外,其余各组皮下注射40%CCl4花生油溶液3ml/kg,每周2次,用10%京都二锅头酒当作唯一饮用水,共12周,造模第一天开始给药。每2周称一次体重。所有动物正常饲养。实验各组在给药8周后和给药12周后分别取材,然后检测血清中与肝脏功能相关的生化指标和血清中透明质酸（HA）、层粘蛋白（LN）的含量,以及肝组织中羟脯氨酸（Hyp）的含量和α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、转化生长因子β1（TGF-β1）、血小板衍生生长因子-BB（PDGF-BB）、结缔组织生长因子（CTGF）的表达情况,并对大鼠的肝组织进行病理形态学特征的描述。1水飞蓟宾微球粉针剂对肝功能生化指标的影响1.1水飞蓟宾微球粉针剂对肝纤维化大鼠血清中ALT、AST含量的影响结果显示:模型组大鼠血清中的ALT、AST含量明显升高（P＜0.001）,给药8w和12w后,各给药组血清中的ALT、AST含量较模型组明显降低（P＜0.05或P＜0.001）。给药8w后,水飞蓟宾微球50mg/kg组和25mg/kg组血清中ALT的含量较水飞蓟宾葡甲胺注射剂组和水飞蓟宾胶囊组明显降低（P＜0.01或P＜0.001）。给药12w后,各给药组间血清中AST的含量相比较无明显差异。1.2水飞蓟宾微球粉针剂对肝纤维化大鼠血清中ALP含量的影响结果显示:模型组大鼠血清的ALP含量明显升高（P＜0.001）。给药8w后,水飞蓟宾微球50mg/kg组血清中ALP的含量较模型组明显降低（P＜0.05）。给药12w后,水飞蓟宾微球各个剂量组血清中ALP的含量较水飞蓟宾胶囊组明显降低（P＜0.05或P＜0.01）。1.3水飞蓟宾微球粉针剂对肝纤维化大鼠血清γ-GGT的影响结果显示:模型组大鼠的血清γ-GGT含量明显升高（P＜0.001）。给药8w后,水飞蓟宾微球50mg/kg组和25mg/kg组血清中γ-GGT的含量较模型组明显（P＜0.05或P＜0.01）。给药12w后,水飞蓟宾微球各个剂量组血清中γ-GGT含量较模型组和水飞蓟宾胶囊组均明显降低（P＜0.05或P＜0.01）。1.4水飞蓟宾微球粉针剂对肝纤维化大鼠血清中TP含量的影响结果显示:模型组大鼠的血清TP含量明显降低（P＜0.001）。给药8w后,水飞蓟宾微球各个剂量组血清中TP的含量较模型组和水飞蓟宾葡甲胺注射组比均明显升高（P＜0.01或P＜0.001）。给药12w后,水飞蓟宾微球各个剂量组TP的含量较模型组比有升高的趋势,但是差异无统计学意义。综合与肝功能相关的五个生化指标的检测结果,说明水飞蓟宾微球粉针剂具有保护肝细胞、改善肝功能的作用,可以延缓肝纤维化的发生。2水飞蓟宾微球粉针剂对细胞外基质相关成分的影响2.1水飞蓟宾微球粉针剂对肝纤维化大鼠血清中HA含量的影响结果显示:模型组大鼠的肝组织中HA的含量明显升高（P＜0.001）。给药8w后,水飞蓟宾微球50mg/kg组血清中HA的含量较模型组明显降低（P＜0.05）。给药12w后,各给药组血清中HA的含量均高于水飞蓟宾葡甲胺注射剂组（P＜0.05或P＜0.001）。2.2水飞蓟宾微球粉针剂对肝纤维化大鼠血清中LN含量的影响结果显示:模型组大鼠肝组织中LN的含量明显升高（P＜0.001）。给药8w后,各给药组与模型组相比无明显差异;给药12w后,水飞蓟宾微球50mg/kg组大鼠血清中LN的含量明显低于模型组、水飞蓟宾葡甲胺注射剂组和胶囊组（P＜0.05）。2.3水飞蓟宾微球粉针剂对肝纤维化大鼠肝组织Hyp含量的影响结果显示:模型组大鼠的肝组织中Hyp的含量明显升高（P＜0.001）。给药8w后,水飞蓟宾微球50mg/kg组大鼠的肝组织中Hyp的含量较模型组比明显降低（P＜0.01）。给药12w后,水飞蓟宾微球各个剂量组肝组织中Hyp的含量较模型组明显降低（P＜0.01）,各给药组组间比较无明显差异。综合此实验部分的三个指标的检测结果,推测水飞蓟宾微球粉针剂可以通过抑制肝纤维化过程中细胞外基质合成或促进其降解的作用,从而降低细胞外基质的含量,最终可以减缓肝纤维化的进展。3水飞蓟宾微球粉针剂对肝纤维化发生机制中相关指标的影响3.1水飞蓟宾微球粉针剂对肝纤维化大鼠肝组织中α-SMA含量的影响结果显示:模型组大鼠的肝组织中α-SMA的含量明显升高（P＜0.001）。水飞蓟宾微球50mg/kg组在给药8w后α-SMA的含量较模型组和水飞蓟宾胶囊组明显降低（P＜0.05或P＜0.001）。给药12w后,各给药组肝组织中α-SMA的含量较模型组均明显降低（P＜0.01或P＜0.001）。3.2水飞蓟宾微球粉针剂对肝纤维化大鼠肝组织中TGF-β1含量的影响结果显示:模型组大鼠的肝组织中TGF-β1的含量明显升高（P＜0.001）。给药8w后,各给药组肝组织中TGF-β1的含量较模型组明显降低（P＜0.01或P＜0.001）;给药12w后,水飞蓟宾微球各个剂量组TGF-β1的含量较模型组和水飞蓟宾胶囊组均明显降低（P＜0.01或P＜0.001）。3.3水飞蓟宾微球粉针剂对肝纤维化大鼠肝组织中PDGF-BB含量的影响结果显示:模型组大鼠的肝组织PDGF-BB的含量明显升高（P＜0.001）。给药8w和12w后,水飞蓟宾微球50mg/kg组肝组织中PDGF-BB的含量较模型组和水飞蓟宾胶囊组明显降低（P＜0.05或P＜0.001）。给药12w后,各给药组肝组织中PDGF-BB的含量较模型组均明显降低（P＜0.05或P＜0.01）。3.4水飞蓟宾微球粉针剂对肝纤维化大鼠肝组织中CTGF含量的影响结果显示:模型组大鼠的肝组织中CTGF的含量明显升高（P＜0.001）。给药8w后,各给药组肝组织中CTGF的含量较模型组明显降低（P＜0.01或P＜0.001）。给药12w后,水飞蓟宾微球50mg/kg和25mg/kg组较和水飞蓟宾葡甲胺注射剂组明显降低（P＜0.01或P＜0.001）（见表和图23、24）。总结以上四个指标的检测结果,推测水飞蓟宾微球粉针剂抗肝纤维化的机制可能是,通过抑制TGF-β1、CTGF抑制细胞外基质的合成;通过抑制PDGF-BB抑制肝星状细胞的增殖,从多个靶点去延缓肝纤维化的发生。4肝组织病理形态学观察4.1肉眼观察大体形态正常组大鼠肝脏色红,边缘锐利,表面光滑细腻;模型组大鼠肝脏明显肿胀,呈蜡黄色,表面凹凸不平,可见细小的结节,及不规则血管突起,给予治疗的各组大鼠肝脏或有细小的结节或结节不明显,但是表面略不平。4.2切片组织病理学观察光学显微镜观察HE/三色（Masson）染色切片标本,可以明显看出各组大鼠肝脏的组织学病变特征:正常组:大鼠肝组织未见明显异常。HE染色见正常肝小叶结构,肝细胞未见明显变性及坏死。三色染色显示:血管壁可见胶原纤维,未见纤维间隔形成。给药8w后模型组:HE染色见肝小叶结构尚存、部分紊乱,大部分肝细胞明显脂肪变性,可见点性状坏死,少量肝细胞内瘀胆,部分汇管区小胆管增生,可见少量的淋巴细胞浸润,小叶内可见增生的纤维组织,少许汇管区周围纤维化（见附图一）。三色染色显示:汇管区可见明显增生的纤维组织,肝小叶中央静脉周围纤维化较为明显,假小叶尚未形成。各给药组:HE染色可见肝小叶结构尚存,肝细胞轻度脂肪变性,可见点性状坏死,汇管区略扩大,小叶内少见增生的纤维组织。三色染色显示:汇管区可见少量增生的纤维组织,肝小叶中央静脉区纤维化不明显（见附图三）。给药12w后模型组:HE染色显示正常肝小叶结构消失,中度增生的纤维组织将肝小叶分割成大小不等的假小叶,大部分肝细胞明显脂肪变性,可见点灶状坏死,汇管区小胆管明显增生,可见淋巴细胞浸润,汇管区明显增宽、增粗,有明显的纤维束形成,较粗而密,相邻的汇管区或中央静脉之间己形成明显的纤维间隔,部分肝细胞内可见瘀胆,呈早期肝硬变表现（见附图二）。三色染色显示:汇管区可见大量的纤维组织增生,假小叶已经形成。增生的纤维组织将肝组织分割成大小不等的假小叶。各给药组:HE染色可见肝小叶结构尚存,肝细胞中度脂肪变性,偶见点灶状坏死,汇管区扩大,小叶内可见少量增生的纤维化组织。三色染色显示:纤维增生受到明显抑制,肝小叶中央静脉周围呈现不明显的纤维化（见附图四）。比较各给药组与模型组染色后的结果可以看出:水飞蓟宾微球粉针剂有保护肝细胞的形态、维持肝组织的结构、防止胶原纤维的增生等作用。5总结本研究采用CCl4+酒精的复合方法复制肝纤维化模型,选择水飞蓟宾微球50mg/kg、25mg/kg和12.5mg/kg、水飞蓟宾葡甲胺注射剂（25mg/kg）以及水飞蓟宾胶囊剂（25g/kg）等,从肝功能相关生化指标、肝脏组织形态和细胞外基质代谢等多个角度进行了观察,为临床应用和药物开发提供了实验依据。在实验中发现,水飞蓟宾微球粉针剂在降低血清中ALT、AST和γ-GGT的含量、升高TP的含量,降低血清中HA、LN和肝组织中Hyp的含量及抑制肝组织中TGF-β1、PDGF-BB、CTGF表达等方面的作用与水飞蓟宾葡甲胺注射剂和水飞蓟宾胶囊剂接近,因此水飞蓟宾微球粉针剂可以通过保护肝细胞、改善肝功能、抑制细胞外基质的合成和促进其降解等方面的作用,延缓肝纤维化发生。另外,水飞蓟宾微球50mg/kg在降低血清中ALT、γ-GGT、LN的含量和升高TP的含量上的作用甚至优于水飞蓟宾葡甲胺注射剂和胶囊剂,这可能与微球的肝靶向定位有关。综合实验部分的所有指标,在对水飞蓟宾微球50mg/kg、25mg/kg和12.5mg/kg三个剂量在不同时间点的作用效果的对比后,建议临床上参考用药剂量是:水飞蓟宾微球50mg/kg、每15日用1次药,连续用药12周。因此,水飞蓟宾微球粉针剂作为一种防治大鼠肝纤维化的新型给药系统的制剂,具有良好的临床应用前景,其机制还有待进一步研究。