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前言 蛋白激酶B（PKB）是丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶，它与蛋白激酶A和蛋白激酶C具有相似的氨基酸序列，所以又叫RAC（related to A and C Kinase）蛋白激酶。目前在人体内已克隆出PKB三种亚型，PKBα、PKBβ和PKBγ，PKBα和PKBβ在人体内广泛表达，而PKBγ主要在脑、心脏和肾脏中表达。自从1995年发现PKB是磷脂酰肌醇3-激酶（PI3-K）的直接下游靶物以来，PKB就成为信号转导深入研究的焦点。 PKB在蛋白质和脂类合成、葡萄糖代谢与运输、细胞周期演进和基因调控、抑制细胞凋亡、促进血管形成和肿瘤转化等方面发挥重要的作用。PKB处于多个信号转导通路的交叉点，成为生长因子介导的PI3-K信号转导通路中的重要组成因子。肿瘤细胞自身可以分泌大量的生长因子，它们通过自分泌或旁分泌方式与细胞表面的生长因子受体结合，激活一系列信号转导途径，从而促进细胞增殖。因此，研究生长因子介导的信号转导途径具有一定的临床应用价值。现已发现许多生长因子如EGF、PDGF、VEGF、IGF-1和bFGF等能与酪氨酸蛋白激酶受体结合，激活PI3-K，产生Ins（3，4，5）P3和Ins（3，4）P2，二者与PKB的PH结构域结合，使之转位至细胞膜处，在磷脂酰肌醇依赖激酶1（PDK1）和磷脂酰肌醇依赖激酶2（PDK2）作用下，PKB的Ser473和Thr308分别被磷酸化，活化的PKB再转位至细胞核内（目前机制尚不清楚），参与核内相关基因的转录，而且活化的PKB通过磷酸化BAD和激活胱冬肽酶caspase-9又可发挥抗凋亡的活性。 关于碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）通过PI3-K／PKB信号途径调控鼻咽癌细胞增殖的具体机制仍不清楚。本文通过改变bFGF作用于 CNE4鼻咽癌细胞的时间，检测细胞浆和细胞膜PKB活性和即早基因C心S的表达情况，进一步研究bFGF通过P13－K／PKB通路调控鼻咽癌细胞生长的信号转导机制。因此，我们设想通过阻断PI3－K／PKB信号转导通路抑制肿瘤细胞生长，诱导肿瘤细胞凋亡，这为治疗肿瘤提供了新思路。 实验材料与方法 1．实验材料 1．l 实验对象 CNEJ鼻咽癌细胞系，由本实验室传代培养。 1．2 试剂 RPMI 1640培养基为GibCOI BRL公司产品；组蛋白ZB购自Roche公司；cAMP依赖性蛋白激酶抑制剂（PKI）、Wortmannin。PMSF购自Siglna公司；兔抗c人s多克隆抗体（美国NeoMarkers产品，进口分装）购自福州迈新生物公司；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG为Promega公司产品；辣根过氧化物酶发光试剂盒购自北京中山生物技术公司；bFGF购自北京双暨药业有限公司／－’中］ATP购自北京亚辉生物工程公司；EGTA和二硫苏糖醇（DTh）购自华美公司；其它试剂为国产分析纯。 1．3 仪器 二氧化碳培养箱(日本HIThCIT－41型人超净工作台(苏州净化设备厂厂紫外灯，高、低速离心机(美国 Sorvall ST－70X超声波细胞粉碎仪 UP 50H(GS（USA）公司人液问仪(美国 Beck。man1801型厂分光光度计(日本岛津260型厂DY－I型电泳仪(上海医疗仪器公司X电泳槽回京六一仪器厂厂DY一皿型电转移槽门京六一仪器厂人 2．实验方法 ·2· 2．1 细胞培养：CNE－l细胞以含有10％小牛血清的RPMI 1640培养基于 37℃5％CO。的培养箱培养。 2．2 细胞处理及分组：选择生长状态良好的细胞，无血清饥 饿 18 h，然后在无血清培养基中加人 bFGF孵育，按下述分组进行 处理。随机分组做bFGF作用的时间曲线，bFGF作用时间分别为 0、15、30、45、60、90min，bFGF的终浓度为 50ng／Inl；力人N 《特 异性抑制剂提曼青霉素（Wortmannin）预处理 lh后做 bFGF作用 的时间曲线，bFGF作用时间分别为 0、15、30、45、60、90min，bFGF 的终浓度为50n牙Inl。 2．3 活性测定：同位素标记法检测酶活性。 2．4 检测即早基因 c七s的表达：West，＊ Blot。 2．5 蛋白含量测定：考马斯亮蓝结合法归radford Assay人 2．6 统计学分析：SPSS．0，Image JI．26。 实验结 果 ＊bFGF对CNE一互鼻咽癌细胞胞浆PKB活性的影响：PKB 活性在 bFGF作用30min时达到高峰，与对照组相比升高了 3．2 倍，PI3五抑制剂 Wortxnannin预处理 lh后再施加 bFGF，PKB活性 恢复到基础水平。 2．bFGF对 CNE－I鼻因癌细胞胞膜 PKB活性的影向：PKB 活性在 bFGF作用 45 min时达到高峰，与对照组相比升高了 3．二 倍，PI3l抑制剂 Wofhaannin预处理 lh 后再施加 bFGF，PKB活性 恢复到基础水平。 3．bFGF对 CNE河鼻咽癌细胞即早基因 Ch 的影响：当外 源性bFGF（终浓度为50ng／Inl）以不同时间作用于 CNE－I细胞 时，c中表达增加，在30ndn时间点达到高峰，与对照组相比升高 1倍，Wortmannin预处理