论文部分内容阅读
目的：本研究通过定量蛋白质组学方法比较远癌正常组织、不同肿瘤相关糖类抗原(Tn)表达的结直肠癌组织的差异表达糖蛋白,以期筛选到与结直肠癌发生发展相关的糖蛋白,为进一步研究与Tn抗原相关O型糖蛋白在结直肠癌发生发展过程中的作用打下基础,并为结直肠癌的诊断、预后监测和防治提供新的靶标。方法：收集2011年11月到2012年4月9例中南大学湘雅二医院病理确诊结直肠癌患者术后新鲜结直肠癌组织和距癌旁5-10cm以外的正常结直肠肠粘膜组织,根据Tn染色结果分为Tn阳性结直肠癌组(Tn+组)、Tn阴性结直肠癌组(Tn-组)和正常结直肠粘膜组织组(正常组),按分组选取部分组织分别提取组织总蛋白,采用相对和绝对定量同位素标记(isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ)联合二维液相色谱串联质谱(2DLC-MS/MS)的定量蛋白质组学技术对各组总蛋白进行差异蛋白质组学分析,所得差异蛋白及肽段信息经ProteinPilot软件进行分析,运用Uniprot、DAVID数据库对差异蛋白质分类进行分析,得出差异表达的糖蛋白和O型糖蛋白；再根据String、GO、KEGG数据库对糖蛋白相互关系及O型糖蛋白相互关系和功能聚类、代谢途径分类进行分析；根据初步分析结果,从差异表达O型糖蛋白中选取核心蛋白多糖(Decorin,DCN)和含山梨醇和SH3结构域蛋白1(Sorbin and SH3domain-containingprotein1,SORBS1)分别进行组织和细胞表达水平的蛋白质免疫印迹(Western Blot,WB)验证。结果：1、iTRAQ标记的2D LC-MS/MS结果：共有1051种非冗余差异蛋白被鉴定,其中有定量信息,且≥2条匹配肽段在95%置信区间内的蛋白质有750种；Tn-组与正常组之间存在差异的蛋白有330种,Tn+组与正常组之间存在差异的蛋白有317种,Tn-组与Tn组+之间存在差异的蛋白有316种；Tn-组与Tn+组之间的差异蛋白质中,糖蛋白共55种,O型糖蛋白19种,19种O型糖蛋白中,其中12种在Tn-、Tn+、正常组,两两之间均存在差异。2、差异蛋白质相互作用分析：55种糖蛋白中,K8和K18独立1个相互作用网,35种蛋白形成1个相互作用网,占所有蛋白质的63.64%,余18种蛋白不在相互作用网内；而在19种O型糖蛋白中,K8和K18仍然是独立的1个关系作用网,10种蛋白质处于同一个关系作用网中,占所有蛋白质的52.63%,余7种蛋白不属于任何相互作用网。3、差异O型糖蛋白GO功能聚类及KEGG代谢途径分类：(1)生物进程功能注释分类,发现19种O型糖蛋白主要参与了代谢过程、调节生物过程、细胞代谢过程等10种生物进程,其中参与代谢过程的差异蛋白12种,占63.12%,参与调节生物进程的差异蛋白质10种,占52.63%；(2)分子功能注释分类,发现这些差异O型糖蛋白参与结合、结构分子活动、催化活性、酶调节活性、抗氧化活性、转运活动6种分子功能,其中参与结合功能的差异O型糖蛋白占68.42%；(3)细胞组成功能注释分类,发现差异O型糖蛋白参与了细胞部分、细胞器、细胞器部分部分等8种细胞组成成分,其中参与细胞部分、细胞器部分、细胞器的蛋白质分别占57.89%、73.68%、52.63%;(4) KEGG代谢途径分类,12种差异O型糖蛋白参与了25条代谢途径,4条信号通路。其中Fibronectin和Heat shock protein HSP90-beta参与的代谢途径最多,Decorin, SORBS1, Heat shock protein HSP90-beta三种蛋白分别参与了四种信号通路。4、根据初步相互关系和功能聚类分析结果,从以上O型糖蛋白中选择Decorin、SORBS1两种蛋白质,分别在Tn-、Tn+结直肠癌组织/细胞及正常结直肠粘膜组织中进行Western Blot验证,结果显示以上2种蛋白质表达水平变化与其蛋白质组学结果一致,即Tn-、Tn+结直肠癌组织中Decorn、SORBS1较正常结直肠粘膜组织表达均下调,同时Tn+结直肠癌细胞或组织较Tn-组表达水平明显降低。5. Decorin、SORBS1两种蛋白的表达量,在不同肿瘤分化程度、分期、性别、年龄组间其表达量也存在差异,但是除在不同分化程度之间表达量差异具有统计学意义外,其余均无统计学意义。结论：1、本研究发现Tn-、Tn+结直肠癌组织之间及与远癌正常结直肠粘膜组织两两之间均存在明显差异表达的O型糖蛋白谱；其中Keratin8、Keratin18、Decorin、sorbin and SH3domin-cotaining protein1(SORBS1)、CD44antigen,与结直肠癌的发生发展以及Tn抗原表达相关,为进一步筛选结直肠癌发生发展相关蛋白和临床诊断预警指标,以及研究O型糖蛋白在结直肠癌发生发展的作用机理奠定了基础。2、差异表达O型糖蛋白的蛋白质相互作用和功能聚类分析发现,19种O型糖蛋白中,12种蛋白质处于2个不同关系作用网中,余7种蛋白不属于任何相互作用网；19种O型糖蛋白主要参与了代谢过程、调节生物过程、细胞代谢过程等不同生物进程,表现出结合、结构分子活动、催化活性、酶调节活性、结构分子活动、转运活动等不同的分子功能；但与结直肠癌发生的关系尚需进一步研究。3、O型糖蛋白Decorin、SORBS1的表达量下调与结直肠癌的发生发展相关,可望成为结直肠癌诊断、预后监测和防治的新靶标。