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目的:结肠癌是严重威胁人类健康的重大疾病。仅在2018年,据统计全球就有约110万结肠癌新发病例和60万死亡病例。目前,晚期结肠癌最主要的治疗手段是化疗,但其毒副作用通常较大,限制了患者的药物耐受剂量和总体治疗时间,从而严重影响了化疗的疗效。靶向治疗是降低化疗毒副作用的重要策略,一般通过选择性药物递送系统(SDDS)来实现,该系统通常由三部分组成:抗肿瘤药物,药物的纳米载体,以及与载体结合的肿瘤靶向配体。SDDS可将抗肿瘤药物靶向递送到肿瘤,并减少正常组织对药物的摄取,有助于提高疗效和降低毒副作用。核酸适配体(aptamer)是一类具有重大应用潜能的肿瘤靶向配体。Aptamer是具有特定序列的单链DNA或RNA,能形成复杂的三维结构,特异性地与靶标分子结合。Aptamer不仅具有较高的靶标亲和力和特异性,且比抗体更易穿透肿瘤组织。此外,aptamer可化学合成,制备成本较低,且易被多种功能基团修饰,因此是具有较大应用前景的肿瘤靶向配体。Holliday junction(HJ)是一种具有良好载药潜力的DNA纳米结构。HJ是由4条单链DNA(ssDNA)配对形成的十字架纳米结构,构建简单,具有良好的生物相容性,且尺寸较小,可更有效地进入肿瘤组织和淋巴结。此外,HJ十字架结构具有4个端点,可同时连接4个肿瘤靶向适配体,从而提高对肿瘤细胞的亲和力。基于上述优点,HJ可作为一种良好的药物载体,但迄今为止,文献尚未见将aptamer修饰的HJ结构用于结肠癌靶向治疗的相关研究。本课题计划构建一种由4个AS1411 aptamer修饰的HJ结构,装载抗肿瘤药物阿霉素(doxorubicin,Dox),构成一种新型SDDS,并评估该系统在体外能否靶向杀伤结肠癌细胞,以及在体内能否提高对结肠癌的治疗效果。方法:利用碱基互补配对原则,通过自组装的方式,构建出由4个AS1411 aptamer修饰的HJ结构(Apt-HJ),利用琼脂糖凝胶电泳检测其配对情况,并通过动态光散射测定Apt-HJ的粒径与Zeta电位。将Apt-HJ用FAM荧光标记,利用流式细胞分析技术检测其是否可以特异性地与CT26结肠癌细胞结合。对该DNA结构进行硫代修饰,血清消化后,用琼脂糖凝胶电泳检测Apt-HJ的血清稳定性。将阿霉素载入Apt-HJ结构中,构建成载有阿霉素的Apt-HJ(Apt-HJ-Dox),通过检测阿霉素的荧光光谱评估Apt-HJ的载药能力,并用于后续实验。利用共聚焦显微镜观察Apt-HJ-Dox被细胞摄取以及在细胞内的定位情况。通过MTS实验,在体外测定Apt-HJ-Dox对结肠癌细胞的杀伤能力以及对对照细胞的毒性。动物实验评估Apt-HJ-Dox在体内的抗肿瘤疗效与毒副作用。结果:在本研究中,我们设计并制备了一种新型SDDS(Apt-HJ-Dox),该SDDS由4个AS1411 aptamer修饰的HJ结构(Apt-HJ)装载抗肿瘤药物阿霉素构成,用于结肠癌的靶向治疗。Apt-HJ结构的平均直径为12.45 nm,带负电荷(-11.6mV)。血清消化实验表明,硫代修饰后的Apt-HJ的血清稳定性明显高于未修饰的DNA结构。流式分析发现Apt-HJ分子与CT26结肠癌细胞的亲和力显著高于单价的AS1411 aptamer。通过阿霉素荧光光谱分析,测得Apt-HJ的载药率约为1:17(Apt-HJ:阿霉素)。Confocal成像显示Apt-HJ能够选择性地将阿霉素递送到结肠癌细胞,并主要定位于细胞核。MTS实验发现Apt-HJ-Dox可以靶向杀伤结肠癌细胞,而显著降低对对照细胞的毒性。动物实验发现,与游离阿霉素相比,Apt-HJ-Dox具有更强的抗肿瘤疗效,且毒副作用并未增加。结论:本研究构建了 AS1411 aptamer修饰的HJ结构来承载阿霉素,用于结肠癌的靶向治疗。Apt-HJ-Dox在体外可选择性地将阿霉素递送到小鼠结肠癌细胞,并在体内显著增强抗肿瘤效应,在结肠癌的靶向治疗方面具有一定的应用潜能。