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生物素(Biotin)又称维生素H、辅酶R,是维持有机体正常生理功能的重要辅助因子,参与机体内羧化、脱羧和转羧基的反应,现已被广泛应用到医药、食品、饲料等多个领域。本文通过克隆不同来源的生物素操纵子及相关基因,以大肠杆菌(Escherichia coli BL21(DE3))为表达宿主,构建得到三株产生物素的工程菌,并优化了发酵条件。从枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis 168)基因组中克隆出其生物素合成操纵子bioWAFDB,以pET28a为载体构建表达质粒,转化E.coli BL21(DE3)后筛选得到重组菌BM01(E.coli BL21(DE3)/pET28a-bioWAFDB);从恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida KT2440)基因组中克隆出其生物素合成操纵子bioBFHCD和编码7,8-二氨基壬酸氨基转移酶基因bioA,利用双启动子表达载体pACYCDuet-1构建表达质粒,转化E.coli BL21(DE3)后得到重组菌PM01(E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-bioBFHCD-bioA),初步比较了两株重组菌的生物素产量,结果表明,P.putida KT2440的生物素操纵子在大肠杆菌中表达时合成生物素的能力较强。由于E.coli BL21(DE3)和P.putida KT2440均不含有编码庚二酰辅酶A合成酶的基因,为使重组菌能够利用庚二酸作为生物素的合成前体,须在宿主中引入庚二酰辅酶A合成酶基因,另考虑到生物素合成途径中多步反应有辅酶S-腺苷-L-蛋氨酸(SAM)参与,强化宿主菌中SAM的合成可能会促进生物素合成代谢。因此,本研究利用表达载体pETDuet-1构建表达质粒pETDuet-bioW-sam2,以引入来自B.subtilis 1 68的庚二酰辅酶A合成酶基因bioW,并过表达来自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae ZJU001)的 SAM 合成酶基因sam2。因 pETDuet-1 和pACYCDuet-1能在同一菌体兼容共表达,最终构建获得重组菌PM02(E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-bioBFHCD-bioA,pETDuet-bioW-sam2)。对上述重组菌的发酵培养基进行优化。综合考虑生产成本和生物素产量,考察不同碳源和氮源对三株工程菌生物素产量的影响,确定了葡萄糖和甘油为较适宜的碳源,NH4C1、蛋白胨和酵母膏为较适宜的氮源。培养基中添加适量的前体物质庚二酸对携有bioW的重组菌BM01和PM02的生物素合成有明显的促进作用。还考察了金属离子对生物素合成的影响,结果表明Fe2+和Fe3+能促进生物素合成,培养基中添加终浓度为5mM的FeCl2可使工程菌PM02的生物素产量提高到60 mg/L。另外,添加适量的辅酶SAM或SAM前体物L-蛋氨酸都可以促进三株工程菌生物素的合成。对PM02而言,L-蛋氨酸的效果更为明显。当添加200 mg/L的L-蛋氨酸时,PM02摇瓶发酵生物素产量达102 mg/L,是原始大肠杆菌的50倍。在15 L发酵罐中进行分批补料发酵,三株工程菌BM01、PM01、PM02生物素产量分别为211 mg/L、260 mg/L、417 mg/L,其中PM02的生物素产量是原始大肠杆菌的200倍。