1建立同时检测三种真菌毒素膜免疫芯片方法的研究真菌毒素(Mycotoxin)是由真菌产生的有毒次级代谢产物,主要污染粮食及饲料等,一旦通过食物链进入人体后,将可能造成致癌、致畸和致突变等严重危害。目前比较常见的检测方法有薄层层析法、高效液相色谱法和ELSIA等。膜免疫芯片技术是指将抗原或抗体固定于膜载体上的蛋白质芯片技术,不仅简单快速、可同时检测多种物质,而且结果易于判读,特别适合于大量样本的现场检测。在本实验室已制备出黄曲霉毒素B1 (Aflatoxin B1,AFB1)、赭曲霉毒素A (Ochratoxin A, OTA)和玉米赤霉烯酮(Zearelenone, ZEN)三种真菌毒素检测抗原及其相应单克隆抗体的基础上,本研究通过将抗原固定于膜载体,根据间接竞争免疫学原理,建立了可同时并能定性检测三种真菌毒素的膜免疫芯片方法。结果如下：(1) AFB1、OTA和ZEN膜免疫检测方法的研究以PVDF膜为固相载体,采用一种新型的、简单的点样方法,对点样缓冲液、抗原固定条件和封闭方式分别进行了优化,确定了以Tris-HCl缓冲液(含10%甘油和0.1%海藻糖,pH 8.5)为点样缓冲液、37℃湿盒孵育2h、5%脱脂牛奶封闭1h为最佳反应条件,在此基础之上确定了：AFB1检测抗原点阵浓度为125μg/mL、抗AFB1单克隆抗体浓度为1/2000时,AFB1检测阈值为2.0ng/mL；OTA检测抗原点阵浓度为10μg/mL、抗OTA单克隆抗体浓度为1/5000时,OTA检测阈值为2.0 ng/mL；ZEN检测抗原点阵浓度为40μg/mL、抗ZEN单克隆抗体浓度为1/5000时,ZEN检测阈值为3.0 ng/mL。(2)同时检测AFB1、OTA和ZEN膜免疫芯片方法的建立在研究结果(1)的基础上,建立了同时检测AFB1、OTA和ZEN膜免疫芯片的方法,该方法对AFB1/OTA/ZEN三种真菌毒素的检测阈值为2.0/2.0/3.0ng/mL,20%的甲醇浓度对检测结果未见有明显影响。同时,研究了膜免疫芯片的特异性、重复性和稳定性等,该方法制备的膜免疫芯片与脱氧雪腐镰刀菌烯醇和伏马菌素B1无明显交叉反应,批内和批间重复均未见检测阈值改变,膜免疫芯片于4℃保存90后用于检测,检测结果未见明显变化。(3)实际样品检测用本研究所制备的膜芯片对12份玉米样品进行检测,肉眼判读结果,检出3份AFB1阳性超标样品和4份ZEN阳性超标样品,其中AFB1和ZEN同时超标的样品有2份,未检出OTA阳性超标样品。其结果与三种真菌毒素商品化ELISA试剂盒检测结果一致。2抗庆大霉素多克隆抗体的制备氨基糖苷类抗生素是一类应用广泛的广谱抗菌药物,主要包括庆大霉素(Gentamicin,GM)、链霉素和卡那霉素等,常用作兽医临床治疗及饲料添加剂,不规范用药会引起畜产品、尤其是牛奶中的药物残留,对人类的健康构成危害。因此,对该类药物进行及时检测是预防和控制其危害的有效手段。本研究进行了抗庆大霉素多克隆抗体的制备研究,旨在建立抗庆大霉素的免疫学检测方法。结果如下：采用碳化亚胺(EDC)法合成庆大霉素的免疫抗原(GM-BSA),用戊二醛法合成庆大霉素的检测抗原(GM-GA-OVA),经SDS-PAGE初步鉴定两种抗原合成成功。用免疫抗原GM-BSA免疫9只Balb／C小鼠,经四次加强免疫后,间接ELISA检测发现,9只老鼠的血清均产生了较高的效价,最高可达1：2.56×105；采用间接竞争ELISA检测抗血清的特异性及交叉反应,并绘制竞争抑制曲线,线性范围为1.0 ng/mL-100.0 ng/mL,以结合率(B／B0)%为纵坐标,以标准浓度对数为横坐标得到回归方程y=-15.5961n(x)+85.847,相关系数R2=0.9985,IC50为10.2 ng／mL,与链霉素、卡那霉素、新霉素和磺胺嘧啶的交叉反应率均小于0.1%。