研究背景及意义下腰痛是多数成年人工作缺勤、就医、住院治疗最普遍的原因,其主要病因是腰椎间盘发生退变[1]。退变本质特征是盘内有核细胞数量减少和功能降低(细胞衰老[2-3]、凋亡[4-5])。最先发生椎间盘退变随病程进展出现腰椎间盘突出、椎管狭窄、甚至瘫痪等神经损伤症状影响正常生活。目前主要通过药物、手术仅限于解除症状,在临床长期的疗效上很局限。近年在微创下注射生长因子、基因治疗、移植生物材料或干细胞为基础的组织工程为求替代髓核并刺激再生成为研究热点。髓核组织工程为重建退变椎间盘结构和功能提供新的治疗方式。健康的、年轻的髓核细胞是作为种子细胞的理想选择,但其体外大量扩增困难、物种来源有限阻碍临床应用。干细胞可以多向分化后可以替代髓核细胞,而且可以较长时间保持髓核细胞形态和表型。人体各个组织中均含有干细胞如脂肪、上皮、牙髓、骨髓、肌肉、腱、经血[6-15]等,如脂肪中干细胞和骨髓间充质干细胞,但大部分种子细胞存在组织中的含量少且有创、来源有限并不能满足临床需要。为此寻找种子细胞新来源已成为髓核组织工程研究中的“瓶颈”难题之一。我们从黄韧带组织中分离出来的干细胞有望成为新的种子细胞,本实验对LFSCs(ligamentum flavum stem cells,黄韧带干细胞)向NP(nucleus pulposus,髓核细胞)分化的可行性进行了实验研究。筛选出纯度较高的LFSCs是实验研究的基础,目前多根据干细胞表面标志物方法使用免疫磁珠筛选、根据细胞大小密度梯度离心、多种介质包被贴壁粘附法等进行初筛上述手段只能去除大部分成熟细胞而且由于价格昂贵和本身干细胞缺少特异性标记物限制其应用。黄韧带干细胞高表达蛋白整合素α5β1和αvβ3,凝血促进干细胞表达α5β1、αvβ3和纤连蛋白,我们可以利用凝血酶和Fibronectin可以很好的粘附黄韧带干细胞而且纯度高。基于在黄韧带干细胞分离、筛选的基础上,从形态变化、免疫表型、CCK8检测增殖能力、流式细胞仪分析细胞周期、干性基因、成骨成软骨成脂肪上探讨黄韧带干细胞的自我更新和多向分化能力。随后模拟椎间盘缺氧、3D共培养模式下,检测诱导分化后黄韧带干细胞表达髓核特异性基因和蛋白表达以评价其可行性。众所周知notch通路在控制分化中占有重要作用,notch通路下游分子twist-1控制干细胞向软骨系分化,而缺氧控制notch通路在分化问题上仍有争议。研究黄韧带干细胞在低氧下是否能向髓核分化需对其机制进一步了解,目前hif-1α调节twist-1是否在黄韧带干细胞向髓核分化中发挥重要作用,尚未见文献报道。我们从干细胞分化表面标志物和特性蛋白发生改变证明了lfscs可以向np-like方向分化。通过构建lentivirus-hif-1α过表达载体观察对twist1表达的影响初步证明其抑制关系,对缺氧因素在向髓核样(软骨系)分化中的作用进行了探讨,以期为髓核组织工程中新的种子细胞来源及其定向分化提供理论基础。研究方法:1.干细胞筛选方法:从微创手术中获得人lf,通过机械-酶消化-组织贴壁法联合获取原代细胞后,接种于4u/ml凝血酶联合8μg/cm2fibronectin、8μg/cm2fibronectin、4u/ml凝血酶和bsa包被过的培养瓶,od值代表粘附率,流式比较筛选百分比。2.自我更新和多能性检测:对干细胞表型、表达相关特异性蛋白、多向分化能力进行检测。从细胞周期、增殖能力和干性基因表达与bm-mscs进行差异比较了解其特征。3.诱导lfscs向np-like细胞分化:模拟低氧环境和3d培养方法,分低氧和常氧组并分别与髓核细胞(npcs)等比例贴附于transwell嵌套系统1μm膜的上下面进行接触式共培养,对照组为20%o2培养的黄韧带干细胞。rt-pcr检测共培养第14天髓核特异性表达基因sox-9,collagen-ii,aggrecan,krt19,ca12,foxf1,hif-1α。蛋白质印迹法测试aggrecan,collagen-ii,hif-1α和sox9。流式细胞仪检测低氧下共培养黄韧带干细胞0天,14天,21天分化表型变化及免疫组化染色检测collagen-i、collagen-ii、aggrecan表达情况。4.低氧下黄韧带干细胞产生的hif-1α对其notch通路中twist1的影响:构建hif-1α慢病毒过表达载体,瞬时转染黄韧带干细胞48小时观察twist1荧光变化。采用成软骨分化培养液培养hif-1α慢病毒过表达的黄韧带干细胞,阿里新兰染色观察第3、7天成软骨变化,未转染为阴性对照组。rt-pcr检测第3天和第7天微球软骨诱导培养的黄韧带干细胞twist1、ii型胶原、蛋白聚糖基因表达水平,wb定量检测6h、24h、48htwist1的蛋白变化情况。结果:1.黄韧带干细胞高表达α5β1和αvβ3,使用8μg/cm2fibronectin和4u/ml凝血酶包被培养瓶筛选黄韧带干细胞筛选后细胞呈均一长梭形,粘附率od值明显高于对照组(p<0.05),筛选纯度高。2.lfscs表面标志物cd105+,cd44+,cd73+,cd90+和cd29+。cd45-,cd34-,cd133-,stro-1-。三系分化:alizarinred阳性,oilredo染色可见红色脂滴形成,alcianblue染色可见大量细胞外基质agg呈阳性表现。表达骨标志物:oc、alp、runx-2,脂肪标志物:lpl、app、ppar2,软骨标志物:colii、agg、sox9显著上调,其中runx-2在未诱导组有低水平表达。免疫组化比较lfscs和bm-mscs均表达α-sma、colli、fibronectin,都不表达collii。与bm-mscs比较有相似增殖能力。细胞周期分析lfscs和bmscs处于g0/g1期比例均超过80%。nonag、sox2在lfscs和bm-mscs之间表达无统计学差异(p>0.05),而oct-4在lfscs中表达水平明显高于bm-msc(p<0.05)。3.经过14天接触性共培养后,rt-pcr检测分化后黄韧带干细胞表达髓核特异性标志物krt19,ca12,acan,col2a1,sox-9,hif-1α低氧组均明显高于常氧组(p<0.05),而foxf1在2%o2和20%o2之间无明显差异(p>0.05)。western-blot检测蛋白colii、agg、sox9、hif-1α与基因水平一致,其中hif-1α在对照组也有低水平表达。4.低氧共培养的黄韧带干细胞表型在分化过程中发生变化,黄韧带干细胞高表达cd105、cd271,低表达gd2、tie2、cd24,诱导共培养14天后干性抗体均有下降趋势而cd24表达上调。21天后cd24、cd271低表达,而cd105、gd2、tie2为阴性。免疫组化提示随着lfscs向np-like发生分化,表达特异性蛋白collii、agg,未表达colli。5.微球软骨诱导小球在第3天和第7天时,过表达hif-1α组阿利新兰染色较未转染组染色深。realtime-pcr过表达hif-1α抑制notch通路中twist1的表达,促进ii型胶原和蛋白聚糖的表达(p<0.05)。瞬时转染48小时twist1荧光染色显示转染组荧光明显减弱,蛋白定量6小时、24小时、48小时twist1表达量逐渐下降(p<0.05)。结论:1.本研究通过对微创手术取下的黄韧带组织中含有的干细胞进行筛选方法的研究并对干细胞进行了鉴定,确立了4u/ml凝血酶联合8μg/cm2fibronectin粘附法,该方法可显著提高lfscs的粘附率,以利于lfscs的分离与筛选。并发现了lfscs表达stro-1为阴性,与bm-mscs相比oct-4表达水平高。证明了lfscs具备自我更新和多向分化潜能的特征。2.基于模拟体内椎间盘低氧和共培养方式诱导lfscs向np-like分化,为探讨LFSCs作为髓核组织工程种子细胞的可行性。现总结如下:1)在低氧下LFSCs与NP共培养,我们根据目前研究鉴定向髓核分化比较有特异性的标志物,从形态、表型变化、基因和蛋白表达水平验证了黄韧带干细胞在低氧情况下更有利于向髓核分化,有望成为组织工程种子细胞。2)本实验进一步研究了低氧下黄韧带干细胞表达HIF-1α抑制Notch通路下游基因Twist1的表达,Twist1的作用抑制软骨系分化,故HIF-1α相当于促进了向软骨系分化的进程,但调控具体机制还需进一步长时间体内证实。3)我们应用流式细胞技术从干细胞分化过程的表型变化入手,鉴定了分化表型的变化。提示在体外分化成某一阶段有特定表型,如分化成髓核的祖细胞或前体细胞,既可以维持定向分化又可以降低成瘤的风险。对将来种子细胞移植入椎间盘后的命运具有重要意义。