[研究背景]自身免疫性肝炎（AIH）是三种自身免疫性肝脏疾病之一，在各种族、年龄段和性别均有发病，以女性和儿童多见。AIH病人对免疫抑制治疗的反应非常好，但是，如果不及时治疗，则预后比较差（Krawitt 1996）。因此，该病预后的关键是早期正确的诊断。然而，目前尚没有一项理想的、特异性实验室诊断指标。其诊断须结合血清学检查（高IgG）、肝活检、临床表现及非特异性自身抗体（ANA、SMA、pANCA和LKM等）的存在进行综合判断。在所有的AIH病人中，约20％的病人出现抗可溶性肝抗原／肝胰抗原（抗-SLA／LP）抗体，这是目前唯一的一项具有100％特异性的实验室指标（Wies et al．2000）。可溶性肝抗原／肝胰抗原（SLA／LP）是一种可溶性细胞浆蛋白，分子量约50kDa，在体内各组织中包括胚胎中广泛表达，但在肝、胰、肾、肺等酶代谢活跃的器官高表达，活化的T细胞也过量表达，推测其可能为一种或一组酶（Wies et al．2000）。另有研究指出，SLA与UGA serine tRNA-protein complex有关，可能是硒代半胱氨酸代谢途径的重要一员（Costa et al．2000）。SLA／LP的化学本质和生物学功能直到最近才被实验证实。研究发现，SLA／LP蛋白是真核生物和古生菌中硒蛋白合成过程中的一个关键酶--磷酸丝氨酰-tRNA：硒代半胱氨酰-tRNA合成酶，催化磷酸丝氨酰-tRNA转化为硒代半胱氨酰-tRNA，从而将用于蛋白质合成的第21种氨基酸--硒代半胱氨酸运输到核糖体，合成硒蛋白（Chambers et al．1986；Zinoni et al．1986；Yuan et al．2006；Xu et al．2007）。目前，对SLA／LP蛋白的表达调控知之甚少，尚未见相关文献发表；同时对SLA／LP蛋白在AIH中的自身免疫作用机理也不清楚。因此，如果对SLA／LP了解的多一些，对明白SLA／LP的自身免疫性及AIH的发病机理都会有帮助。为此，本课题计划建立sla／lp基因敲除鼠模型，并对sla／lp基因的启动子进行定位，寻找存在的转录因子，并确定其在SLA／LP蛋白表达中的调控作用。[研究目的]创建sla／lp基因敲除鼠模型，研究其表型变化，进一步阐明SLA／LP功能，同时为SLA／LP功能及AIH的相关研究提供一个比较理想的动物模型。[研究方法] （1）利用基因克隆技术，构建基因敲除载体。（2）将基因敲除载体电转到胚胎干细胞（R1 ES）中，通过同源重组完成基因序列的置换。（3）药物筛选耐药克隆，Southern Blot筛选阳性重组子克隆。（4）用显微注射方法，将发生重组后的ES细胞注射到来自C57BL／6鼠的3.5天的囊胚中，并移植到代孕母鼠体内，以产生嵌合体小鼠。（5）将雄性嵌合体小鼠与野生型雌性C57BL／6小鼠交配，获得杂合体小鼠。（6）将杂合体小鼠交配，获得基因敲除纯合体小鼠。（7）分析基因敲除鼠的表型变化。[结果]构建的基因敲除载体含有两个同源序列，分别称作5’Arm和3’Arm。5’Arm长2007bp，含有从内含子2-3到外显子3的序列；3’Arm长4256bp，含有从内含子6-7到外显子8的序列。同源重组后，将敲掉自外显子3到内含子6-7之间长约5867bp的一段序列。在5’Arm后，加入了EGFP基因；在两个同源序列之间含有阳性选择标记-新霉素基因；在两个同源序列之外含有阴性选择标记-单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV-tk）基因，用于阳性重组胚胎干细胞克隆的药物筛选。将构建的基因敲除载体电转到ES细胞中后，用G418和ganciclovir筛选耐药克隆。在400多株耐药克隆中，Southern Blot分析确定了3株阳性重组子克隆。利用阳性ES细胞诞生了7只具有高度嵌合性的雄性嵌合体小鼠。因为ES细胞来自129／Sv小鼠，囊胚来自C57BL／6小鼠，故嵌合体小鼠毛色为黑色和棕色。将嵌合率高于80％的雄性嵌合体小鼠与野生型C57BL／6雌鼠杂交后，后代均为黑色，PCR检测无新霉素基因的存在，未产生应该为棕色的杂合体子代小鼠。[结论]基因敲除载体被成功构建，且可产生嵌合体小鼠，但是遗传性状无法传递给子代。需选择其他阳性ES细胞克隆重复进行显微注射，或者构建新的敲除载体，以克服遗传性状不能传递的缺陷。第二部分：sla／lp启动子的鉴定及其特点[研究目的]对sla／lp基因的启动子进行定位，寻找可能存在的转录因子及其作用，从转录水平上阐明sla／lp基因在正常组织中的表达调控，揭示SLA／LP蛋白在AIH病人中产生自身免疫性损伤的部分机理。[研究方法] （1）利用基因克隆技术将一长1740bp的小鼠sla／lp基因片段克隆到荧光素酶报告载体—pGL3 basic vector。（2）将构建的质粒分别转化到HEK293，RAW264.7和Hepa1-6这三种不同的细胞系中进行荧光素酶实验。（3）荧光素酶实验证实该1740bp片段具有起始转录功能后，经系列5’端剪切和3’端剪切定位核心启动子位置。（4）利用计算机软件预测可能存在的转录因子结合位点，检测对这些位点进行点突变后各克隆荧光素酶活性的变化，从而初步确定这些转录因子结合位点是否存在及其作用。（5）利用凝胶迁移实验（EMSA）和超凝胶迁移实验（Super shift）对转录因子结合位点加以确认。[结果] （1） 1740bp小鼠sla／lp基因片段位于转录起始点上游并含盖转录起始点（-1623～+117）。荧光素酶实验证实其具有启动子活性并且活性具有方向性，表达在三种细胞中无差异。（2）经过系列剪切后，具有起始转录功能的最短片段定位于-99～-37，一个长63bp片段内。（3）该63bp片段不存在典型的核心启动子元件，如TATA盒，起始子（Inr），下游启动子元件（DPE）和TFIIB识别元件（BRE）。（4）CpGProD和Alibaba2.1软件预测，sla／lp基因启动子很可能是CpG岛型启动子，并预测在63bp片段内存在两个Sp1结合位点（-85～-76和-55～-41），一个RAP1结合位点（-71～-62）。在63bp片段上游存在一个Oct-1结合位点（-184～-175）。（5）63bp片段内的两个Sp1结合位点及RAP1结合位点分别经过点突变后，所产生的克隆几乎完全丧失起始转录的功能；而Oct-1结合位点的点突变克隆则可以在不同的细胞系中提高转录能力2.8到6.3倍。（6）这4个转录因子结合位点的凝胶迁移实验均出现了滞后带；其中，Sp1（-85～-76）和Oct-1（-184～-176）的Super shift实验出现超滞后带，证实了这两个位点的存在；而Sp1（-55～-41）和RAP1（-71～-62）结合位点未出现超滞后带，故尚不能确定它们一定存在。[结论] （1） sla／lp基因的启动子为CpG岛型启动子，核心启动子位于一个长63bp的片段内，位于转录起始点上游-99～-37的位置，不含有典型的核心启动子元件，内含一个转录活化因子Sp1、一个Sp1样和一个可能的RAP1结合位点。其上游含有转录抑制因子Oct-1结合位点。（2） SLA／LP蛋白在体内正常的广泛表达是转录活化因子Sp1，RAP1和转录抑制因子Oct-1作用之间动态平衡的结果。（3）导致该平衡失衡的因素可能是AIH病人产生抗-SLA／LP抗体的基础。[总结]在建立sla／lp基因敲除鼠模型过程中，成功的构建了基因敲除载体，并顺利地诞生了嵌合体小鼠，但改变后的基因未能成功地传递给子代获得杂合体小鼠，这里面含有许多经验教训，在今后的工作中，许多方面需要给予更多的关注。在ES细胞的培养过程中，要尽量避免或降低各种可能引起分化因素的作用，以最大程度提高遗传性状的可传递性。sla／lp基因的启动子为CpG岛型启动子，核心启动子位于一长63bp片段内，缺乏典型核心启动子元件，如TATA box，Inr，DPE，BRE等；转录因子Sp1是sla／lp基因的转录活化因子，Oct-1为转录抑制因子，同时还可能存在转录活化因子RAP1的结合何点，为一多调节因子型启动子，同时也提示了sla／lp基因表达调控的复杂性。SLA／LP蛋白在体内的正常表达应该是Sp1／RAP1和Oct-1作用动态平衡的结果；引起该平衡失衡的因素可能是导致SLA／LP在AIH中产生自身免疫性的原因之一，因此，进一步寻找这些因素将会是非常有意义的工作。目前找到的调控sla／lp表达的转录因子，无论是活化因子还是抑制因子，均是在体内广泛表达的、无组织特异性的因子，这从一个侧面说明了为什么SLA／LP在体内各组织中广泛表达，而不具有组织特异性。这些转录因子的浓度和活性可能是控制SLA／LP蛋白在各组织中表达量不同的因素之一。同时，这种表达特点也带给我们这样一个问题，即在体内广泛表达的SLA／LP，为什么在AIH中只影响到肝脏，而不影响其他组织器官呢?是因为SLA／LP在AIH病人肝脏中的异常表达造成的吗?但我们的另一个实验结果显示SLA／LP在AIH、其他肝脏疾病以及健康对照之间的表达没有明显差异（Wang et al．投稿）。一个可能的解释是，SLA／LP在肝脏发生的某种修饰作用导致了肝脏特异性、病理性的免疫损伤。的确，硒主要在肝脏代谢，并以硒蛋白的形式运输到其他的组织器官（Gromer et al．2005；Schweizer et al．2005）。在此过程中，受某种因素影响后，可能形成了一种具有抗原性的核糖核蛋白复合物，诱导了针对SLA／LP蛋白的病理性自身免疫反应。当然，这需要后续实验加以证实。