【目的】：通过在重症急性胰腺炎Sprague Dawley(SD)大鼠体内转染人工合成与NF-κB结合位点(5′-GGG ACT TTC C-3′)具高度亲和力的诱捕物寡核苷酸(decoy ODN)了解以下情况：1、诱捕物寡核苷酸在重症急性胰腺炎大鼠体内的转染情况；2、诱捕物寡核苷酸对NF-κB活性的抑制效果；3、诱捕物寡核苷酸对NF-κB活性的抑制后下游炎症因子、粘附因子mRNA的表达情况；4、诱捕物寡核苷酸对NF-κB活性的抑制后对重症急性胰腺炎大鼠肺、肝脏和胰腺早期损伤的影响。【方法】：1．脂质体介导NF-κB decoy ODN在重症急性胰腺炎大鼠肺、肝和胰腺的转染和分布：1．1以5％牛磺胆酸钠制作重症急性胰腺炎(SAP)大鼠模型。1．2 Sprague Dawley(SD)大鼠分组如下：假手术对照组为开腹翻动胰腺，未作任何处理组(n=20)；裸ODN 1h组(n=10)和4h组(n=10)；生理盐水1h组(n=10)和4h组(n=10)；脂质体／错配ODN复合物1h组(n=10)和4h组(n=10)；脂质体／decoy ODN复合物1h组(n=10)和4h组(n=10)。脂质体／ODN复合物或裸ODN 10μl／g，生理盐水1ml，分别于SAP模型建立后1h和4h经尾静脉注射，全部ODN 5′端行异硫氰酸荧光素(FITC)标志即FITC-ODN。各组均在注射4h后用断头法处死大鼠，立刻切取胰腺、肝脏、肺脏组织标本，并置于液氮中保存。1．3胰腺、肝脏、肺脏组织冰冻切片后于荧光显微镜下观察FITC-ODN荧光和DAPI荧光并计算转染率。1．4电泳迁移率变动分析法(EMSA)检测胰腺、肝脏、肺脏组织的NF-κB活性。1．5电泳迁移率变动分析法检测NF-κB诱捕物双链寡聚脱氧核苷酸和NF-κB特异探针分别与NF-κB结合情况比较。试验分组如下：第一组阴性对照组不加任何核蛋白提取物(n=10)；第二组反应系为核蛋白提取物加生理盐水(n=10)；第三组反应系为核蛋白提取物加100倍特异性标记的NF-κB探针(n=10)；第四组反应系为核蛋白提取物加100倍非特异性未标记的SP1探针(n=10)；第五组反应系为核蛋白提取物加decoy ODN(n=10)；第六组反应系为核蛋白提取物加错配ODN(n=10)。所有核蛋白提取物均从生理盐水组提取。2．脂质体介导NF-κB decoy ODN对重症急性胰腺炎大鼠肺、肝和胰腺炎症因子mRNA表达和早期器官损伤的影响2．1以5％牛磺胆酸钠制作重症急性胰腺炎大鼠模型。2．2 Sprague Dawley(SD)大鼠分组如下：假手术对照组为开腹翻动胰腺，未作任何处理组(n=10)；裸ODN组(n=10)；生理盐水组(n=10)；脂质体／错配ODN复合物组(n=10)；脂质体／decoy ODN复合物组(n=10)。脂质体／ODN复合物或裸ODN 10μl／g，生理盐水1ml，分别于SAP模型建立后1h经尾静脉注射。各组均在注射4h后，经腹主动脉抽取血样本进行血气分析(PO2)、淀粉酶检测，下腔静脉抽取血样本进行ALT和AST检测，以上生化检查由南方医院检验科检测；用断头法处死大鼠，立刻切取胰腺、肝脏、肺脏组织标本，并置于液氮中保存；另取大鼠肺、胰腺组织标本，进行肺、胰腺组织湿／干重比值测定；另取肺、胰腺组织标本，进行肺、胰腺组织髓过氧化物酶(MPO)活性测定。2．3电泳迁移率变动分析法检测胰腺、肝脏、肺脏组织的NF-κB活性。2．4电泳迁移率变动分析法检测NF-κB诱捕物双链寡聚脱氧核苷酸和NF-κB特异探针分别与NF-κB结合情况比较。κ试验分组如下：第一组阴性对照组不加任何核蛋白提取物(n=10)；第二组反应系为核蛋白提取物加生理盐水(n=10)；第三组反应系为核蛋白提取物加100倍特异性标记的NF-κB探针(n=10)；第四组反应系为核蛋白提取物加100倍非特异性未标记的SP1探针(n=10)；第五组反应系为核蛋白提取物加decoy ODN(n=10)；第六组反应系为核蛋白提取物加错配ODN(n=10)。所有核蛋白提取物均从生理盐水组提取。2．5 RT-PCR检测胰腺、肝脏、肺脏组织中IL-1α、IL-2、TNF-α、ICAM-1和VCAM-1 mRNA的变化。【结果】：1．1胰腺、肝脏、肺脏组织冰冻切片在荧光显微镜下观察裸ODN组细胞核可见少量散在的FITC-ODN荧光颗粒，荧光呈绿色，从荧光显微镜观察上述三个器官分布无明显差别；DAPI荧光颗粒则比较密集，荧光呈蓝色，从荧光显微镜观察上述三个器官均无明显差别，细胞质均极少见FITC-ODN荧光颗粒和DAPI荧光颗粒。脂质体／decoy ODN复合物组胰腺、肝脏、肺脏组织细胞核内可见较为密集的FITC-ODN荧光颗粒，荧光呈绿色，从荧光显微镜观察肺脏比肝脏密集，胰腺荧光颗粒分布相对稀疏；细胞核DAPI荧光颗粒均比较密集，荧光呈蓝色，从荧光显微镜观察上述三个器官无明显区别，细胞质均极少见FITC-ODN荧光颗粒和DAPI荧光颗粒。脂质体／错配ODN复合物组胰腺、肝脏、肺脏组织细胞质均可见大量密集的FITC-ODN荧光颗粒，细胞核内极少见FITC-ODN荧光颗粒；细胞核DAPI荧光颗粒均比较密集，荧光呈蓝色，从荧光显微镜观察上述三个器官无明显区别，细胞质均极少见DAPI荧光颗粒；生理盐水组和对照组未进行转染FITC-ODN和DAPI染色所以无荧光颗粒。1．2裸ODN组1h与4h FITC-ODN转染率比较，脂质体／decoy ODN复合物组1h与4h FITC-ODN转染率比较，无显著性差异(P＞0.05)；裸ODN组FITC-ODN在体内肺、肝、胰腺器官的分布无显著性差异(P＞0.05)；脂质体／decoyODN复合物组FITC-ODN在肺部的表达较好，肝脏次之，胰腺较差，三者相互之间的差异有显著性(P＜0.05)。脂质体／decoy ODN复合物组FITC-ODN转染率显著比裸ODN组高(P＜0.05)。脂质体／错配ODN复合物组FITC-ODN不在细胞核表达，生理盐水组、假手术对照组未进行转染FITC-ODN所以无转染率。1．3 EMSA结果显示脂质体／decoy ODN复合物组胰腺、肝脏、肺脏NF-κB活性受到明显抑制，与生理盐水组和脂质体／错配ODN复合物组比较有显著性差异(P＜0.05)，与未诱导SAP的假手术对照组比较也有显著性差异(P＜0.05)。脂质体／decoy ODN复合物组1h与4h NF-κB活性比较无显著性差异(P＞0.05)。裸ODN组NF-κB活性未见显著抑制，与脂质体／错配ODN复合物组、生理盐水组NF-κB活性比较无显著性差异(P＞0.05)，裸ODN组1h与4h NF-κB活性无显著性差异(P＞0.05)。1．4 NF-κB特异性探针与NF-κB结合后，NF-κB与核蛋白DNA的结合活性显著被抑制，与非特异性SP1探针与NF-κB结合相比有显著性差异(P＜0.05)；非特异性SP1探针与NF-κB结合后，NF-κB与核蛋白DNA的结合活性被抑制不明显。decoy ODN与NF-κB结合后，NF-κB与核蛋白DNA的结合活性也显著被抑制，与错配ODN与NF-κB结合相比有显著性差异(P＜0.05)；错配ODN与NF-κB结合后，NF-κB与核蛋白DNA的结合活性被抑制不显著(P＞0.05)。decoy ODN与NF-κB结合和NF-κB特异性探针与NF-κB结合相比较，NF-κB与核蛋白DNA的结合活性抑制无显著性差异(P＞0.05)；错配ODN与非特异性SP1探针和NF-κB结合相比较，NF-κB与核蛋白DNA的结合活性抑制也无显著性差异(P＞0.05)。2．1．1脂质体／decoy ODN复合物组血气分析P02有显著的改善，与生理盐水组、脂质体／错配ODN复合物组和裸ODN组相比有显著性差异(P＜0.05)，与假手术对照组相比无显著性差异(P＞0.05)。脂质体／decoy ODN复合物组肺组织水肿程度和MPO活性有所下降，与生理盐水组、脂质体／错配ODN复合物组和裸ODN组比较下降显著，均有显著性差异(P＜0.05)；与未诱导SAP的假手术对照组比较仍有显著性差异(P＜0.05)。裸ODN组血气分析、肺组织湿／干重比值和MPO活性与生理盐水组和脂质体／错配ODN复合物组相比均无明显改善，无显著性差异(P＞0.05)。2．1．2脂质体／decoy ODN复合物组血ALT与生理盐水组、脂质体／错配ODN复合物组和裸ODN组有显著性差异(P＜0.05)，与未诱导SAP的假手术对照组相比无显著性差异)P＞0.05)；AST与假手术对照组、生理盐水组、脂质体／错配ODN复合物组和裸ODN组均有显著性差异(P＜0.05)。裸ODN组ALT和AST与生理盐水组和脂质体／错配ODN复合物组相比无显著性差异(P＞0.05)。2．1．3脂质体／decoy ODN复合物组淀粉酶、胰腺组织湿／干重比值和MPO活性与假手术对照组、生理盐水组、脂质体／错配ODN复合物组和裸ODN组比较均有显著性差异(P＜0.05)。裸ODN组淀粉酶、胰腺组织湿／干重比值和MPO活性与生理盐水组和脂质体／错配ODN复合物组相比无显著性差异)P＞0.05)。2．2 EMSA结果提示脂质体／decoy ODN复合物组胰腺、肝脏、肺脏NF-κB活性受到显著抑制，与未诱导SAP的假手术对照组比较活性依然较高，差异有显著性(P＜0.05)。生理盐水组、脂质体／错配ODN复合物组和裸ODN组胰腺、肝脏、肺脏NF-κB活性减弱不显著，裸ODN组胰腺、肝脏、肺脏NF-κB活性与生理盐水组和脂质体／错配ODN复合物组比较差异无显著性(P＞0.05)。2．3 NF-κB特异性探针与NF-κB结合后，NF-κB与核蛋白DNA的结合活性也是显著被抑制，与非特异性SP1探针与NF-κB结合相比差异有显著性(P＜0.05)；非特异性SPl探针与NF-κB结合后，NF-κB与核蛋白DNA的结合活性被抑制不显著。decoy ODN与NF-κB结合后，NF-κB与核蛋白DNA的结合活性显著被抑制，与错配ODN与NF-κB结合相比有显著性差异(P＜0.05)；错配ODN与NF-κB结合后，NF-κB与核蛋白DNA的结合活性被抑制不显著。decoyODN与NF-κB结合和NF-κB特异性探针与NF-κB结合相比较，NF-κB与核蛋白DNA的结合活性抑制无显著性差异(P＞0.05)；错配ODN与非特异性SP1探针和NF-κB结合相比较，NF-κB与核蛋白DNA的结合活性抑制也无显著性差异(P＞0.05)。2．4．1脂质体／decoy ODN复合物组TNF-α、ICAM-1m RNA的表达均显著下降，与生理盐水组、脂质体／错配ODN复合物组和裸ODN组比较有显著性差异(P＜0.05)，与未诱导SAP的假手术对照组相比有显著性差异(P＜0.05)；VCAM-1m RNA的表达也显著下降，与生理盐水组、脂质体／错配ODN复合物组和裸ODN组比较有显著性差异(P＜0.05)，与假手术对照组相比无显著性差异(P＞0.05)。裸ODN组ICAM-1、IL-1α、IL-2、TNF-α、VCAM-1 mRNA的表达水平均较高，与生理盐水组和脂质体／错配ODN复合物组相比无显著性差异(P＞0.05)。脂质体／decoy ODN复合物组IL-1α表达上升显著，上升水平与生理盐水组、脂质体／错配ODN复合物组和裸ODN组相比有显著性差异(P＜0.05)，与假手术对照组相比有显著性差异(P＜0.05)。脂质体／decoy ODN复合物组IL-2表达也上升，与假手术对照组相比无显著性差异(P＞0.05)。2．4．2肝脏各个炎症因子的mRNA变化情况与肺脏情况相同。脂质体／decoyODN复合物组TNF-α、ICAM-1 mRNA的表达均显著下降，与生理盐水组、脂质体／错配ODN复合物组和裸ODN组比较有显著性差异(P＜0.05)，与未诱导SAP的假手术对照组相比有显著性差异(P＜0.05)；VCAM-1 mRNA的表达也显著下降，与生理盐水组、脂质体／错配ODN复合物组和裸ODN组比较有显著性差异(P＜0.05)，与假手术对照组相比无显著性差异(P＞0.05)。裸ODN组ICAM-1、IL-1α、IL-2、TNF-α、VCAM-1 mRNA的表达水平均较高，与生理盐水组和脂质体／错配ODN复合物组相比差异无显著性(P＞0.05)。脂质体／decoyODN复合物组IL-1α表达上升显著，与生理盐水组、脂质体／错配ODN复合物组和裸ODN组相比有显著性差异(P＜0.05)，与假手术对照组相比有显著性差异(P＜0.05)。脂质体／decoy ODN复合物组IL-2表达也上升，与假手术对照组相比无显著性差异(P＞0.05)。2．4．3脂质体／decoy ODN复合物组TNF-α、ICAM-1、VCAM-1 mRNA的表达均显著下降，与生理盐水组、脂质体／错配ODN复合物组和裸ODN组比较有显著性差异(P＜0.05)，与未诱导SAP的假手术对照组相比有显著性差异(P＜0.05)。裸ODN组ICAM-1、IL-1α、IL-2、TNF-α、VCAM-1 mRNA的表达与生理盐水组和脂质体／错配ODN复合物组相比无显著性差异(P＞0.05)。脂质体／decoy ODN复合物组IL-1α和IL-2表达上升显著，与生理盐水组、脂质体／错配ODN复合物组和裸ODN组，有显著性差异(P＜0.05)，与假手术对照组相比有显著性差异(P＜0.05)。【结论】：1、脂质体在一定程度上可以转染NF-κB decoy ODN进大鼠体内，但是其本身的靶向性将改变被转运物质的靶向性；2、NF-κB decoy ODN需要借助载体转染才能提高其在靶细胞的浓度，但是其靶向性又明显受载体靶向性的干预；3、NF-κB诱捕物(decoy)对重症急性胰腺炎时NF-κB有较强的亲和力和对NF-κB激活有显著的抑制作用；4、重症急性胰腺炎时NF-κB的激活或抑制对炎症因子表达水平有显著的上调或下调的作用；5、NF-κB decoy ODN降低重症急性胰腺炎炎症因子表达水平同时对早期肺、肝和胰腺的损伤有所改善。