糖尿病是常见的内分泌代谢疾病,其引发的多种并发症严重危害人们的身心健康,只有建立内源性胰岛素分泌系统才能根治糖尿病。目前主要有胰腺移植和胰岛移植两种方法能达到此治疗目的。与胰腺移植相比,胰岛移植具有手术创伤性小、可重复性好、安全、并发症少等优势,但供胰量大（需要2个成人的胰腺）、移植物长期存活率低仍是阻碍胰岛移植发展的“瓶颈”。目前,胰岛在移植后早期（7—10天）有70%的胰岛失功。这一现象除了与免疫排斥反应有关以外,还与移植后胰岛的凋亡、丧失细胞外基质（“Anoikis”）以及缺血、缺氧等诸多因素造成的胰岛原发性无功能（PNF,Primary nonfunctlon）有关。若能克服上述因素减少移植胰岛失功则可达到提高移植成功率和减少所需移植胰岛数量的目的。AKT,亦称蛋白激酶B（ptotein kinase B,PKB）属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族成员,AKT分子量为57KD,根据其产生的组织特异性不同,将AKT分为三种亚型,即AKT1、AKT2、AKT3,它们之间的同源性可达82%。其中AKT1广泛产生于各种组织中,能受多种激活剂调节活化;AKT2也广泛产生,并在卵巢癌和胰腺癌细胞中过量产生;AKT3主要在大脑和睾丸中产生。在多种细胞中AKT充当抗凋亡信号激酶的作用,此外AKT还在细胞存活、细胞增殖、细胞代谢和细胞凋亡等活动中扮演着关键角色。综上所述,如能增加胰岛细胞中Akt的表达,从而减少胰岛细胞凋亡和令其分泌功能提高,则对于减少移植胰岛的用量和延长移植物的生存将会有重要意义。目的利用腺病毒载体将Akt1基因转染至分离的大鼠胰岛细胞中,通过对胰岛存活情况和功能的研究,来判定Akt是否可以提高β细胞的存活率和增强其分泌功能。方法1、构建携带蛋白激酶B（AKT）基因的重组腺病毒载体Ad5-Akt1（1）构建穿梭质粒pDC316-Akt1①提取大鼠总RNA。②合成cDNA第一链;用反转录试剂和总RNA逆转录成cDNA第一链。③AKT1基因的PCR扩增;以大鼠肝组织cDNA为模板,PCR扩增此基因的开放阅读框架。引物序列利用Primer 3.0软件设计。④真核表达载体构建;将AKT1基因片段和真核表达载体pDC316用EcoRⅠ、HindⅢ双酶切,电泳后切胶回收目的基因片段和载体片段,T₄DNA连接酶连接,16℃过夜。转化感受态菌DH5α,以含氨苄青霉素的LB选择性固体培养基培养,次日挑取阳性克隆,提取质粒,酶切鉴定重组子。⑤大量提取真核表达载体质粒pDC316-Akt1。2、构建腺病毒载体Ad5-Akt1（1）293细胞接种于六孔板中,每孔5×10⁵个细胞,培养基为DMEM+10%Hyclone胎牛血清,置37℃含5%CO₂的培养箱中培养过夜。（2）取骨架质粒和穿梭质粒,用Lipofectamine2000脂质体按其所附说明书进行转染。（3）待细胞大部分病变并从底部脱落进行收毒。（4）目的基因的鉴定;取病毒上清,进行PCR鉴定,病毒转染293细胞,并用Western blot法检测Akt1表达情况。2、Ad5-Akt1转染大鼠胰岛凋亡和功能影响的实验研究（1）胰岛分组;根据对胰岛的不同处理将分离培养的大鼠胰岛分三组,即实验组（Ad5-Akt1转染组）、空白转染组（Ad5-EGFP转染组）和对照组（单纯培养组）。其中实验组和空白转染组胰岛在培养24小时后加入病毒液,1h后更换新鲜培养液与对照组胰岛在37℃、5%C O₂条件下继续培养。48小时后空白转染组（Ad5-EGFP转染组）于荧光显微镜下观察EGFP表达情况,同时实验组用Western blot法检测Akt1表达情况。（2）流式细胞仪检测转染率（3）胰岛的生存情况检测;①存活率;用丫啶橙/溴乙啶（AO/EB）荧光染色法显示细胞活率。②原位末端核苷酸标记法（TUNEL）检测凋亡情况。（4）胰岛功能检测;①胰岛素含量检测;隔日取各培养孔中上清,分装,-20℃保存,放射免疫法检测胰岛素含量②胰岛素释放实验.计数10IEQ胰岛,用含低浓度葡萄糖（2.8mmol/L）的Kreb’s-Hank’s液（含有10mmol/L HEPES和0.25%牛血清白蛋白）孵育2h,然后用含有高浓度葡萄糖（16.7mmol/L葡萄糖）的Kreb’s-Hank’s液孵育1h,收集第2h和第3h的培养液,采用化学发光免疫方法检测培养液中胰岛素含量,计算胰岛素释放指数（SI）;SI=第3h（高糖环境）的胰岛素含量/第2h（低糖环境）的胰岛素含量。实验中设5个复孔。③抗Insulin-6免疫组织化学;染色方法按链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶（S-P）法试剂盒说明书步骤进行,抗Insulin-6经高压修复预处理,抗原修复液为pH6-0柠檬酸缓冲液。经DAB染色后,苏木素对比染色,中性树胶封片。以PBS代替一抗作为阴性对照,抗Insulin-6阳性涂片作为阳性对照。统计分析;所用数据以平均数±标准差表示,采取t检验,p＜0.05为有统计学差异。结果1、胰岛提取;平均每只大鼠可获得约600IEQ胰岛,经DTZ染色后,纯度＞90%。胰岛活率＞98%。2、经BamHⅢ和EcoRI双酶切电泳和质粒测序证实本研究构建的pDC316-Akt1表达载体构建成功,3、所构建的腺病毒Ad5-Akt1转染293细胞后,经Western blot法检测可以在293细胞中充分表达目的基因Akt1。4、体外培养新分离的大鼠胰岛细胞在加入腺病毒Ad5-EGFP 48h后,在荧光显微镜下观察到胰岛细胞显示了较强的荧光5、腺病毒Ad5-Akt1转染大鼠胰岛可以表达目的基因AKT1,其表达AKT1的量显著高于对照组;6、转染AKT1的胰岛在体外培养的过程中,其凋亡速度明显降低,生存时间延长。而且其产生、分泌胰岛素的量高于对照组。结论1、腺病毒可以成功介导目的基因转染胰岛细胞并且目的基因可以在胰岛细胞中充分表达2、AKT1使体外培养的大鼠胰岛凋亡减慢,生存延长。3、AKT1使体外培养的大鼠胰岛合成及分泌胰岛素的功能明显提高。