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小豆（Vigna angularis）是我国传统的杂粮作物,因其耐瘠薄、抗逆性好、生育期短等特点,是农业生产中常用插茬、换茬的重要作物,在我国农业种植业结构调整中占据重要地位。然而,由豇豆单胞锈菌（Uromyces vignae）引起的小豆锈病可导致叶片干枯脱落,加之锈菌侵染后潜伏期较长,在一个生长季内可造成多次再侵染,若不及时防治,极易导致小豆锈病的大面积流行和危害,严重影响小豆的产量和品质。然而,当前生产中小豆锈病早期诊断技术缺乏,对小豆抗锈病分子机理的认识不清,导致缺少成熟的理论指导防治实践,是小豆绿色高效生产面临的关键科学问题。因此,本研究利用巢式PCR技术,建立了小豆感染豇豆单胞锈菌的早期分子检测体系,应用该体系实现了室内接种条件下的早期检测,为病害早期诊断和防治提供重要的技术支撑。同时,明确了锈菌在接种后不同时间的增殖特点,并在此基础上,利用iTRAQ技术分析了小豆抗锈病品种响应锈菌侵染关键阶段的差异表达蛋白,为深入探索小豆抗锈病的分子机制奠定基础。本研究取得以下重要结果:1.应用常规PCR技术筛选获得了可用于豇豆单胞锈菌检测的特异性引物UV-ITS,在此基础上设计巢式PCR内引物UV-MX,构建了巢式PCR检测体系,该体系在锈菌基因组DNA浓度仅为4×10-6 ng·μL-1时仍可实现有效扩增,其灵敏度是常规PCR的10万倍。应用巢式PCR体系对人工接菌后不同时间的小豆叶片进行检测,发现该体系在接种后12 h即可实现对叶组织内带菌情况的特异性检测。此外,比较接种后不同时间PCR产物的琼脂糖凝胶电泳条带亮度发现,接种后24、48、120 h的产物浓度明显升高,表明上述时间点是锈菌在小豆叶片组织内的快速增殖阶段。2.基于巢式PCR检测结果,选取小豆抗病品种QH1在豇豆单胞锈菌接种后24、48、120 h后的样品,采用iTRAQ技术进行蛋白质组学分析,以接种无菌水为对照,从不同处理样品中共鉴定6899个蛋白。以差异倍数>1.2、p-value<0.05为阈值筛选差异表达蛋白,结果发现,与不接种对照相比,接种后24 h差异表达蛋白36个,上调表达11个,下调表达25个;接种48 h后差异表达蛋白48个,上调表达23个,下调表达25个;接种后120h,共鉴定差异表达蛋白70个,上调表达59个,下调表达11个。上述结果表明,伴随锈菌侵染而持续增强的防御应答是抗病品种QH1表现高抗的关键因素。3.差异表达蛋白功能注释表明,接种后24 h与活性氧代谢相关的SOD、POD显著上调表达,接种后48 h病程相关蛋白PR-2、PR-9和PR-14显著上调表达,接种后120 h病程相关蛋白PR-2、PR-3、PR-4、PR-5和PR-9等显著上调表达。对小豆响应锈菌侵染不同阶段差异表达蛋白的GO和KEGG富集分析发现,接种后24 h活性氧代谢及次生代谢物合成等通路显著富集,表明锈菌入侵早期影响了小豆体内的活性氧水平,进而激活了下游防卫反应。接种后48 h差异表达蛋白在基因表达调控、类黄酮生物合成通路显著富集,接种后120 h差异表达蛋白显著富集在防卫反应、先天免疫反应、类黄酮生物合成、异黄酮生物合成和苯丙烷生物合成等通路,表明锈菌侵染诱导了小豆病程相关蛋白的表达及植保素等次生代谢物的积累,有效抑制了锈菌的定殖和扩展。4.在差异表达蛋白功能注释的基础上,对锈菌侵染不同阶段共有的上调差异表达蛋白分析发现,小豆DIR蛋白在接种后不同时间均显著上调,为深入了解DIR蛋白在小豆抗锈病中的作用,采用qRT-PCR技术分析了小豆6个DIR蛋白编码基因在不同抗性品种中响应锈菌侵染的表达模式。结果表明,在抗病品种中,DIR蛋白在锈菌侵染早期即被显著诱导表达,表达量显著高于感病品种,在抗病品种中表达量达到峰值的时间更早,且不同DIR蛋白响应锈菌侵染的表达模式存在差异。上述结果表明,小豆DIR蛋白在小豆抗锈病中发挥重要作用,该家族的不同成员在应对锈菌侵染时可能发挥不同的作用。