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本文以亚洲百合‘布耐罗’(‘Brunello’)为研究对象,通过对鳞片再生条件、抗生素筛选条件及农杆菌介导百合遗传转化条件的优化,建立了高效的再生及转化体系,并将IPT基因和NPR1基因导入百合,对转化再生植株进行了分子检测及生理指标分析,主要研究结果如下: 1、含NPR1基因的植物表达载体pB35SNPR1的构建。将来自拟南芥的NPR1基因插入到质粒载体pGreen0229中,构建含有卡那霉素抗性选择标记的植物表达载体pB35SNPR1(pGreen0229-35S-NPR1-GFP),并通过液氮冻融法将其导入农杆菌EHA105,用于百合的遗传转化试验。 2、运用正交试验设计,建立亚洲百合‘布耐罗’(‘Brunello’)鳞茎外植体高效再生体系。外植体以1‰(W/V)升汞溶液作为主要灭菌试剂时,内部鳞片其最适处理时间为9min,存活率为55%;中部和外部鳞片的最适处理时间均为15min,存活率分别为50%和45%。运用正交试验设计,筛选鳞茎最佳分化培养基为MS+6-BA2+NAA0.2mg/L,再生率达86.1%以上;筛选出小鳞茎叶的最佳分化培养基为MS+6-BA1+NAA0.2+2,4D0.1mg/L,再生率达78.9%; 3、以鳞片分化的小鳞茎叶基部作为遗传转化体系的受体材料,通过卡那霉素敏感性试验,确定了小鳞茎叶诱导不定芽卡那霉素临界致死浓度为100mg/L。对影响农杆菌转化效率几个主要因素进行的研究发现:选取分化15-20d的小鳞茎叶作为受体材料,在OD值为0.5的农杆菌菌液中侵染15min,侵染后共培养2d可获得较好的转化效果,转化率在16%左右;进一步研究发现,在菌液中添加50μmol/L乙酰丁香酮,在共培养基中添加100μmol/L乙酰丁香酮浓度时,转化率较不添加乙酰丁香酮高。 4、将含质粒pB35SNPR1的农杆菌EHA105与百合小鳞茎叶共培养,通过筛选培养,获得卡那霉素抗性植株,对22株转NPR1再生植株进行GFP荧光检测和PCR检测,其中12株为阳性,经GFP荧光检测和PCR检测表明,NPR1基因已经整合到百合基因组中。对20株转IPT再生植株进行PCR检测,其中11株为阳性。 5、对PCR检测呈阳性的转基因植株进行了生理指标检测,试验结果表明:转基因植株的抗病性和抗衰老性都较阴性对照高。