猪嵴病毒(Porcine kobuvirus)是微小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)嵴病毒属(Kobuvirus)成员。2008年,匈牙利学者首次报道在无临床症状表现的猪粪便中发现猪嵴病毒；2009年,在中国猪群中也检出了猪嵴病毒。自此之后,多个国家报道在猪群中检测到猪嵴病毒,包括泰国、日本、韩国、荷兰、巴西、西班牙、意大利、东非等。猪嵴病毒是一种具有传染性、在世界范围内广泛分布的新型病毒,在腹泻猪中有较高检出率,认为可能是猪腹泻的病原,但鉴于其在没有腹泻的猪群中也普遍存在,且目前尚未能实现体外分离培养,需要更多的研究来阐明其生物学特性及病原特性。本研究旨在对四川地区猪嵴病毒病流行情况进行调查,并对四川株猪嵴病毒VP1基因分子流行病学特点进行分析；VP1蛋白是嵴病毒暴露在最外面的结构蛋白,是嵴病毒的优势免疫蛋白,本研究通过大肠杆菌表达系统,表达猪嵴病毒VP1蛋白优势抗原表位区,利用纯化的重组蛋白建立一种检测猪血清中猪嵴病毒抗体的间接ELISA方法,为今后猪嵴病毒血清学诊断方法的研究奠定基础。本研究在2011-2012年从四川猪场中收集了163份猪粪便和肠道组织样品,其中112份来自腹泻猪,51份来自没有腹泻的猪。利用RT-PCR方法对样品进行检测,猪嵴病毒的总阳性率为53.4%(87/163),腹泻样品中猪嵴病毒总检出率为64.3%(72川2),采集自无腹泻猪的样品中,猪嵴病毒的感染率为29.4%(15/51)。利用SPSS21.0软件对腹泻组数据和无腹泻组数据进行卡方检验,结果显示猪嵴病毒感染和腹泻具有极显著相关性,χ2=17.126,p=3.5×10-5；在哺乳仔猪、保育猪、育肥猪和成年母猪中,猪嵴病毒的感染率依次为：66.7%、39.1%、23.5%、40.0%,对四个年龄段感染数据进行卡方检验,分析显示哺乳仔猪和猪嵴病毒感染具有极显著相关性,χ2=10.941,p=9.4×10-4。腹泻猪和幼龄猪可能对猪嵴病毒更易感。利用RT-PCR扩增猪嵴病毒VP1基因序列,通过分子克隆,测序得到35个猪嵴病毒VP1基因序列(GenBank登录号：KF157917-KF157951),核苷酸序列相似性为80.7%-100%,氨基酸序列相似性为87.2%-100%。利用MEGA5.0软件对猪嵴病毒VP1基因序列进行系统进化分析,结果显示本研究获得的四川株猪嵴病毒分属于四个大的分支,说明多株猪嵴病毒在四川地区流行,进化树显示猪嵴病毒VP1基因序列的分群无明显地域性差异。通过序列分析,表明在两只猪的粪便样品中分别检出3株和2株猪嵴病毒共同感染,首次为多株猪嵴病毒共感染提供了依据；通过重组分析软件RDP和Simplot预测,发现3株共感染的猪嵴病毒A1、A2、A3之间存在重组事件,A2序列的VP1区段可能是由于A1和A3之间发生重组产生的。重组事件的发生会推动病毒基因组的进化,导致基因多样性的发生。本研究通过BepiPred、Bcepred、DNAStar中Protean来预测分析猪嵴病毒VP1蛋白线性抗原表位,综合各种预测结果,选择抗原表位较集中、抗原指数较高的前半段(1-462bp)作为猪嵴病毒优势抗原表位区,将选取的基因片段送公司进行密码子优化后合成基因,将合成的基因片段定向克隆至原核表达载体pET32a(+)中,构建重组表达质粒pET32-VP1,转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中进行诱导表达,通过对诱导条件进行优化,确定37℃C,0.2mmol/L IPTG诱导表达4h为最佳诱导条件,重组蛋白大小为35.6KDa,以可溶性形式存在,在Western blot检测中,通过Ni柱纯化的VP1重组蛋白和猪嵴病毒阳性血清存在特异性反应,说明重组蛋白具有良好的抗原性。利用纯化的重组蛋白作为包被抗原,初步建立猪嵴病毒抗体检测间接ELISA方法,并对间接ELISA反应的各个条件进行优化,结果显示,抗原的最佳包被浓度为2μg/mL,血清最适稀释倍数为1：200,37℃1h+4℃C过夜为重组蛋白最适包被条件,5%脱脂奶粉封闭90min为最适封闭液和封闭时间,待检血清温育时间为60min,酶标二抗工作浓度为1：6000,作用时间为60min, TMB底物作用时间为15min,阴阳性临界值为0.250。建立的间接ELISA检测方法具有较好特异性,与猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪轮状病毒、猪瘟病毒、猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒6种常见猪病病原阳性血清无交叉反应。建立的方法具有较好的重复性,批内重复性实验和批间重复性实验,变异系数均小于10%。用建立的间接ELISA方法,对170份猪血清样本进行检测,结果显示65份血清为猪嵴病毒抗体阳性,阳性率为38.2%。本研究建立的间接ELISA检测方法,为今后猪嵴病毒血清学诊断方法研究奠定了基础。