骨骼肌是动物机体最重要的运动组织与能量稳态调节系统,骨骼肌的功能受到骨骼肌中肌纤维类型的影响,不同类型的肌纤维其运动能力与代谢特征均有所不同,而且,骨骼肌的纤维类型会受到多种内外因素的影响而发生类型间的转化。叶绿醇（Phytol,Phy）是叶绿素分子上的一个长链脂肪醇结构的支链,广泛存在于植物中。人与动物进食含叶绿素的食品后,消化系统能将叶绿醇从叶绿素上解离并摄取入机体内,叶绿醇在肝脏可以被代谢成植烷酸（Phytanic acid,PA）与降植烷酸（Pristanic acid,Pr A）。目前对于叶绿醇生物活性的研究集中在病理学（如神经性雷夫叙姆病的研究）及青储饲料对反刍动物乳汁及肉品质影响的研究领域,有关叶绿醇及其代谢产物对骨骼肌纤维类型的影响除本实验室的前期研究外,尚未见其他报道,其作用机制仍有待揭示。为了深入揭示叶绿醇及其代谢产物对骨骼肌纤维类型的调节作用及其机制,本论文开展了以下五个部分的试验:第一部分:叶绿醇对C2C12细胞系肌纤维类型的影响试验以小鼠骨骼肌成肌细胞系C2C12作为研究模型,在培养液中添加50μM与100μM浓度的叶绿醇,结果发现50μM的叶绿醇可以显著上调C2C12细胞I型和IIa型肌球蛋白重链的蛋白表达水平,同时可以显著上调IIa型、IIb型肌球蛋白重链以及长链脂肪酸（LCFA）胞膜转运载体CD36的表达水平,100μM的叶绿醇可以显著上调CD36与LCFA胞内转运蛋白FABP3的m RNA表达水平。进一步对肌纤维类型相关信号通路蛋白进行检测发现,50μM的叶绿醇可以显著上调PGC-1α/PPARs信号通路中PPARδ与PGC-1α的蛋白表达水平以及胞质中p MEF2A/MEF2A的比例,显著上调Ca2+依赖的Ca MK/MEF2信号通路中Ca MKII的m RNA表达水平。并且100μM的叶绿醇可以显著上调慢肌肌纤维相关mi RNAs中的mi R-499与mi R-208b的m RNA表达量。进一步对细胞线粒体呼吸能力进行检测发现,50μM的叶绿醇可以显著提高C2C12细胞的基础代谢能力、储备代谢能力以及ATP合成能力。以上结果说明:叶绿醇可以上调C2C12细胞的慢肌肌球蛋白重链与氧化型肌球蛋白重链的表达,此作用是通过激活胞内PPARδ/PGC-1α与Ca MKII/MEF2A信号通路实现的,同时LCFA转运相关蛋白CD36与FABP3也参与了此过程,并且可以激活线粒体氧化过程,增强细胞的氧化呼吸能力。第二部分:日粮添加叶绿醇对小鼠骨骼肌纤维类型的影响进一步以对C57BL/6J小鼠作为活体研究模型,结果发现小鼠饲料添加0.5%叶绿醇后,对小鼠的体重、体增重、累计采食量、肌肉相对重量以及脂肪组织相对重量等采样指标无影响,但可以显著增加小鼠爪抓力与运动耐力,增强了小鼠的有氧运动能力。对小鼠腓肠肌与胫骨前肌的组织化学染色结果显示,0.5%叶绿醇饲喂小鼠的这两块肌肉中I型肌纤维比例显著增加,IIb型肌纤维比例显著减少,同时蛋白水平表达检测也显示I型肌纤维的表达有上调的趋势,这与运动能力的增加结果相符。腓肠肌蛋白的信号通路表达检测显示叶绿醇饲喂的小鼠肌肉中PPARδ、PGC-1α、Calcineurin、MEF2A、CD36与FABP3的蛋白表达量显著上调。现有报道LCFA除了作为能量底物,还可以被作为PPARs等核内转录因子的配体起到激活转录的作用,免疫沉淀结果显示,叶绿醇上调了肌肉中LCFA转运蛋白FABP3和PPARδ的互作。以上结果说明:叶绿醇可以促进小鼠骨骼肌由快肌纤维向慢肌纤维转化,即酵解型肌纤维向氧化型肌纤维的转化,表现在小鼠腓肠肌与胫骨前肌肌纤维组成比例的改变,以及增强小鼠的肌肉力量与运动耐力上,在这个肌纤维类型的转化过程中发生了叶绿醇分子从胞外向胞内、从胞内往核内的转运,激活了PPARδ/PGC-1α与Calcineurin/MEF2A信号通路以及LCFA的转运,并且叶绿醇可以作为PPARδ的转录因子配体激活其转录活性。第三部分:叶绿醇代谢产物植烷酸与降植烷酸对C2C12细胞肌纤维类型的影响试验选择C2C12细胞作为模型,观察了50μM浓度的植烷酸与降植烷酸对肌纤维类型的影响。结果表明,50μM的植烷酸对C2C12肌纤维类型并没有影响,I型与IIa型肌球蛋白重链的表达没有发生改变,同时信号通路检测表明其PPARδ、PGC-1α、Calcineurin、MEF2A、CD36与FABP3的蛋白表达都无变化,仅有p MEF2A水平上升,但其与MEF2A的比例与对照组相比无变化。50μM的降植烷酸处理C2C12细胞后,I型肌球蛋白重链表达量显著上升,IIa肌球蛋白重链表达量无变化,LCFA转运蛋白CD36与FABP3表达量无变化,PPARδ、Calcineurin以及MEF2A表达量显著上升,p MEF2A含量上升,但p MEF2A/MEF2A比例无变化,进行FABP3的转位检测发现,FABP3在降植烷酸处理后没有发生细胞定位的改变,细胞线粒体呼吸检测显示降植烷酸能显著提升C2C12细胞的储备代谢能力,但对细胞的基础代谢以及ATP合成能力无影响。以上结果说明:叶绿醇的两个代谢产物中,植烷酸对细胞肌纤维类型无影响,对相关信号通路无激活作用。降植烷酸则可以显著提高C2C12细胞的慢肌肌纤维表达,主要是通过Ca2+依赖的Calcineurin/MEF2A信号通路实现其调控,PPARδ的表达上调可能是来自Ca2+信号通路对于其基因的表达激活,但降植烷酸没有激活LCFA转运机制,FABP3的细胞定位没有发生改变也说明降植烷酸没有进入细胞作为PPARδ的配体发挥转录激活作用,基础代谢与ATP合成没有增强的结果也说明降植烷酸并没进入细胞内作为能量底物进入线粒体氧化代谢中。第四部分:转录组分析叶绿醇及降植烷酸对C2C12细胞的影响前文研究结果表明,叶绿醇与降植烷酸都能影响C2C12细胞的肌纤维类型,但两者的作用机制似乎不同,因此我们进一步开展了转录组学分析。DEGs（差异表达基因）分析中,Phy vs Con比对组富集出有显著差异的DEGs为3896个,远多于Pr A vs Con组的197个。GO生物功能注释结果中,Phy vs Con与Pr A vs Con比对组分别富集出192与62个生物功能注释。KEGG信号通路富集结果中,Phy vs Con与Pr A vs Con比对组分别富集出8条与1条具有显著性的信号通路（P<0.05）,KOBAS信号通路富集结果显示,Phy vs Con与Pr A vs Con比对组分别富集出86条与7条具有极显著性的信号通路。从Phy vs Con与Pr A vs Con中筛选的肌纤维类型相关DEGs的转录后调控结果中可以发现,叶绿醇主要通过LCFA转运/代谢、PPARδ/PGC-1α以及Ca MKII/MEF2A通路对肌纤维产生影响,降植烷酸主要通过PPARδ与细胞呼吸对肌纤维类型产生影响。以上结果说明:叶绿醇与降植烷酸对C2C12细胞肌纤维类型的影响机制有较大的差异,且叶绿醇对C2C12细胞的影响程度比降植烷酸大。第五部分:叶绿醇调节肌纤维类型的机制研究使用慢病毒包被的sh RNA-CD36表达载体进行C2C12细胞的感染以及对C57BL/6J小鼠腓肠肌的病毒注射后,对C2C12细胞进行叶绿醇处理以及小鼠饲喂0.5%叶绿醇添加饲料后发现,CD36干扰可以消除C2C12细胞中叶绿醇处理引起的I型肌球蛋白重链、PPARδ与CD36的蛋白表达上调。腓肠肌干扰CD36的小鼠饲喂叶绿醇后,其运动能力的增强效果被消除,肌肉力量与运动耐力显著降低到对照组水平,腓肠肌中I型、IIb型肌纤维的比例也随着CD36的干扰显著下降到对照组水平,进一步检测腓肠肌蛋白中的信号通路分子蛋白表达量同样说明,腓肠肌中CD36的干扰直接消除了叶绿醇对肌纤维相关信号通路分子的上调作用,其表达水平显著下降至对照组水平。与此同时胫骨前肌则因为没有注射病毒,I型和IIb型肌纤维的比例保持在叶绿醇饲喂组的水平。以上在活体和离体试验结果均表明:叶绿醇调节肌纤维类型转化的机制首先是通过CD36介导。