黄梁木（Neolamarckia cadamba）又名团花,是茜草科（Rubiaceae）团花属（Neolamarckia）多年生落叶乔木,因其树型通直优美、材质优良、活性代谢产物丰富,适用于园林绿化、工业用材和医药原料等,开发利用前景十分广阔。过去对黄梁木的研究主要集中在引种栽培、药效成分鉴定和药理学分析,而在分子设计育种和多抗新品种培育方向的研究几乎空白。转基因是研究植物功能基因的重要技术手段,也是加快新品种培育十分便捷的途径。然而,目前黄梁木还没建立起高效的再生体系和遗传转化体系。值得庆幸的是,植物组织培养技术和转基因技术已日趋成熟,为批量化生产性状优良的黄梁木种苗和开展分子育种提供了技术支撑。本研究对组织带内生菌的野生黄梁木茎段进行常规灭菌,同时配合使用细菌和真菌抗生素,开展内生菌的药敏性试验;另一方面,以黄梁木无菌苗叶片为外植体建立了黄梁木再生体系,并在此基础上借助高通量测序技术和生物信息学方法,系统研究黄梁木胚性愈伤组织形成的分子机制;此外,通过优化影响转化效率的各因素,建立了农杆菌介导的黄梁木遗传转化体系;最后构建cry1Ac-CBF1双价基因表达载体并转化黄梁木,获得了转基因植株。主要结果如下:1、黄梁木内生菌污染控制。以多年生黄梁木树上的嫩茎段为材料,分析不同类型抗生素及其浓度对黄梁木组培中内生菌的抑制效果。结果表明,黄梁木组培过程中的污染是由细菌和真菌共同导致的结果,联合使用细菌抗生素和真菌抗生素对内生菌抑制效果最好。外植体在300 mg/L硫酸链霉素和800 mg/L氟康唑抗生素的培养基中生长正常,且污染率低至30%。此外,抗生素对内生菌的抑制有一定的时效性,及时将茎段上萌发的嫩叶接种到诱导培养基上可以再生不定芽,不仅提高了增殖效率,还进一步防止内生菌的再次污染。2、建立黄梁木离体组织繁殖再生体系。叶片在不同种类的植物生长调节剂下诱导出3种不同的愈伤组织,其中只有Type II愈伤可以分化成胚性愈伤和再生不定芽。在MS基础培养基中添加3 mg/L TDZ、0.1 mg/L 2,4-D和0.05 mg/L NAA对胚性愈伤的诱导效果最好,平均每个外植体获得8个不定芽,同时诱导出新形体结构。新形体的分化能力非常强,在0.5 mg/L 6-BA和0.05 mg/L NAA中可以分化出不定芽和新的新形体结构,进入下一轮的增殖和再生。另外,叶片的发育时期和接种方式对再生效率有显著的影响,再生能力较强的外植体材料是自植株顶端向下的第1～2片叶,以远轴面向下放置培养的再生效率高于近轴面向下。3、黄梁木胚性愈伤形成的转录组学分析。以构建的黄梁木再生体系为基础,利用Illumina Hiseq X Ten测序平台构建了黄梁木叶片胚性愈伤分化时期的转录组文库。无参转录组拼接共获得74584个Unigenes,其中有18003个在整个愈伤诱导过程中差异表达。对不同时期的基因表达水平进行连续两两比较分析发现,愈伤分化启动阶段（YS02 vs.YS01）中有9353个Unigenes差异表达,其中4244个上调表达;愈伤分化后期（YS03 vs.YS02）有9435个Unigenes差异表达,其中4084个上调表达。此外,两个不同阶段的比较发现有5892和5974个基因分别仅在两个发育阶段特异性差异表达,3461个基因在两个发育阶段均差异表达。转录组中共鉴定到324个差异表达转录因子,大多数的差异表达转录因子在愈伤诱导初期上调表达。经KEGG富集和拟南芥同源基因比对分析,筛选到34个与生长素和细胞分裂素信号通路相关基因及36个胚胎发生相关基因在黄梁木胚性愈伤组织形成过程中起重要作用。这些基因可作为研究黄梁木体细胞胚胎发生的分子机制以及构建选择性删除转化体系的候选基因。4、黄梁木遗传转化体系的建立。确定侵染过程中使用OD600=0.2～0.4的侵染液侵染预培养2天的外植体,经0.1 Mpa真空处理10 min,侵染30 min后共培养4 d,可显著提高转化效率。外源基因的整合和表达情况通过GUS染色、PCR、YFP荧光信号检测和RT-PCR得到了确认。该体系可为黄梁木的分子育种和基因功能研究提供技术支撑。5、黄梁木抗虫耐寒转基因研究。通过改建pCAMBIA1305载体,将cry1Ac和AtCBF1基因组装到pCAMGWB2＿cry1Ac＿CBF1载体上。利用本文建立的再生体系和遗传转化体系,将cry1Ac-At CBF1双价表达载体转入黄梁木中。PCR和Southern杂交的检测结果证明目的基因已整合进黄梁木基因组中。q RT-PCR检测发现外源基因在不同的转化植株中的表达量有明显的差异,但是两个基因在同一植株中的表达水平趋势基本一致。