论文部分内容阅读
微生物宏基因组（Metagenome）是指某一生境中所有微生物遗传物质的总和。土壤中存在大量资源微生物，但99%的微生物不能在实验室条件下培养，传统分离培养技术存在很大的弊端。宏基因组技术绕过培养的限制，为活性物质及功能基因的筛选提供了一条新的思路。本研究以浙江天目山土壤为材料，摸索土壤细菌宏基因组DNA的提取方法，构建了天目山土壤宏基因组文库并进行了功能基因的筛选，克隆得到了一个几丁质酶基因。详细结果如下：1.比较分析了不同土壤细菌DNA提取方法，通过优化得到了土壤细菌DNA提取的最佳方案，提取获得的DNA可以满足粘粒文库构建需求。通过比较分析分散后差速离心处理、分散后蔗糖梯度密度离心、琼脂糖凝胶包埋法、裂解法、透析袋法、冻融法等细菌细胞提取及DNA提取方法，总结出了土壤细菌DNA提取纯化的最佳方法：用0.2%焦磷酸钠溶液混匀土壤，在搅拌器中匀浆分散，匀浆后的土壤溶液600×g低速离心，所得上清10,000×g高速离心获得土壤细菌，采用CTAB碱裂解法，高温辅助裂解，低熔点琼脂糖凝胶与琼脂糖酶消化相结合回收土壤DNA。2.构建了基于粘粒的天目山土壤细菌宏基因组文库。将提取获得DNA进行Sau3AⅠ部分酶切，连接到Bam HⅠ、ScaⅠ酶切后的pLAFR-5粘粒上，经过Lambda噬菌体蛋白包装，转染大肠杆菌DH5α，平板菌落推测，得到容量含有约10,000个克隆的文库，达到土壤细菌宏基因组文库的要求。3.筛选获得了一个能降解几丁质的菌株，菌株对番茄灰葡萄孢表现出明显的拮抗活性。将得到的粘粒克隆进行DNA序列测定，发现其中含有一个几丁质酶基因。该基因1623bp，编码541个氨基酸。序列比对分析该基因编码蛋白质属于几丁质酶18家族基因，具有良好的抑菌和杀线虫的应用潜力。本课题通过宏基因组技术，构建了天目山土壤的细菌宏基因组文库，筛选获得了一个高活性拮抗病原真菌的几丁质酶基因。课题为进一步开发天目山微生物资源提供了良好的思路，也为微生物农药资源及其功能基因挖掘探索出新的途径。