抗生海洋放线菌的筛选及其次级代谢物活性的研究

来源 :曲阜师范大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:icqn2007
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海洋放线菌由于特殊的生态环境可能会产生各种不同于陆地微生物的生物活性物质,进而可以从中找到新的有效药物分子来抑制多种病原微生物及治疗肿瘤等恶性疾病。本研究对日照海洋沉积物中的海洋放线菌进行分离筛选,并对筛选到的一株高生物活性的海洋放线菌进行条件优化及代谢产物活性研究,为后续分离纯化出结构新颖、功能独特、低毒副作用的次级代谢产物提供了理论依据。(1)采用5种不同的处理方法和5种不同的筛选培养基从日照海洋沉积物中分离筛选出105株海洋放线菌,通过拮抗黄曲霉活性筛选,获得一株对黄曲霉具有较强抑制活性的抗生菌株SSRRZ-B11。经16S rDNA序列分析,并结合形态观察及生理生化试验,确定菌株SSRRZ-B11为锈赤蜡黄链霉菌(Streptomyces rubiginosohelvolus)。(2)通过单因素实验优化海洋锈赤蜡黄链霉菌SSRRZ-B11菌株产抑菌活性物质的发酵条件,结果显示最适培养基为改良ISP2培养基;最适培养条件为:接种量为5%、培养温度30℃、初始pH 7.0、培养时间11 d、装液量为90 mL/300 mL。通过P-B实验设计,确定了温度、培养时间和接种量为主要影响因子,通过最陡爬坡实验及响应面实验对产抑菌活性物质的发酵条件进行了研究,确定最适培养条件为:温度29℃、培养时间11 d、接种量5%,在此条件下实际抑菌活性物质的抑菌圈直径达到(29±0.1)mm,与原始发酵条件相比,抑菌活性物质活性提高了51.72%。(3)使用沉淀法对海洋锈赤蜡黄链霉菌SSRRZ-B11菌株产抑菌活性物质进行初步提取,结果发现,80%饱和度下硫酸铵沉淀对黄曲霉的抑制活性保持率达到82.1%。因此可以用硫酸铵分级沉淀法来对拮抗黄曲霉活性物质进行初步提取。并在此基础上探讨了抑菌活性物质的温度、酸碱性、储藏时间、遗传稳定性,结果表明:SSRRZ-B11菌株所产抑菌活性物质对温度比较敏感,在60℃以下具有较高的稳定性;pH在410这一范围内能够保持稳定;储存到515 d之内其抑菌活性降低不显著,仍具有较强的活性;并且具有较好的遗传稳定性,这些研究为今后该抑菌活性物质的分离纯化提供了一定的理论依据。(4)对筛选到的抗生菌株海洋锈赤蜡黄链霉菌SSRRZ-B11进行细胞活性检测,发现其能显著抑制人肺癌A549细胞的增殖,发酵原液的ID50值高达460。对抗生菌株所产抗肿瘤活性代谢产物进行极性实验,发现能够通过乙酸乙酯萃取到大部分的抗肿瘤活性物质,说明该抗肿瘤活性物质大部分为中等极性的代谢产物。抗肿瘤活性物质的温度、酸碱稳定性实验结果表明,该活性物质在4080℃及pH 711条件下具有良好的稳定性。通过细胞周期检测发现抗肿瘤活性物质倍数依赖性地使A549细胞的S期细胞数量增多,说明主要将人肺癌A549细胞阻遏至S期。细胞凋亡实验结果表明抗肿瘤代谢产物粗提物稀释到1.6×104、3.2×104和6.4×104倍均可明显诱导人肺癌A549细胞发生凋亡。
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