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第一部分SMS2基因敲除对小鼠胰岛功能的影响目的:探究SMS2缺失对小鼠胰岛功能的影响。方法:以SMS2基因敲除(SMS2-KO)小鼠作为研究模型,分离两组小鼠胰岛,体外行GSIS(glucose-stimulated insulin secreting,葡萄糖刺激胰岛素分泌试验)和 KSIS(potassium-stimulated insulin secreting,钾离子刺激胰岛素分泌试验),观察SMS2缺失对小鼠胰岛葡萄糖刺激下胰岛素分泌的影响(WT,n=3;SMS2-KO,n=3);透射电镜观察静息状态下胰岛的超微结构,评估两组小鼠胰岛β细胞内胰岛素囊泡数量、大小及密度;胰腺切片胰岛素IHC染色(Immunohistochemisty,免疫组化)、胰高血糖素IHC染色,观察两组小鼠胰岛中α细胞和β细胞的增殖情况;Real-time PCR 比较两组小鼠增殖基因、凋亡基因及胰岛素合成相关基因的表达。结果:(1)与WT小鼠相比,SMS2-KO小鼠胰岛在16.7mM葡萄糖刺激下胰岛素分泌虽有下降趋势,但未达到统计学意义;与WT小鼠相比,SMS2-KO小鼠胰岛在50mM氯化钾刺激下胰岛素分泌显著下降,有统计学意义;(2)电镜下胰岛细胞亚细胞器高尔基体、线粒体及内质网均未见明显异常。与WT小鼠相比,SMS2-KO小鼠β细胞内分泌性囊泡面积增大,密度下降,致密核灰度下降,均有统计学意义;(3)胰岛素、胰高血糖素IHC染色结果示:与WT小鼠相比,SMS2-KO小鼠胰岛α细胞/β细胞比值无明显变化;增殖基因Pdx1、凋亡基因Ki67及胰岛素合成基因Ins1和Ins2的表达无明显变化。结论:SMS2缺失导致胰岛GSIS下降,可能与β细胞胰岛素囊泡变化有关。第二部分SMS2基因敲除损伤小鼠胰岛功能机制初步探讨目的:探究SMS2缺失损伤小鼠胰岛功能的机制。方法:以SMS2基因敲除(SMS2-KO)小鼠、SMS2差异性表达的稳定INS-1细胞株(干扰SMS2表达的INS-1细胞株(INS-1 shRNA-SMS2)、SMS2过表达的INS-1细胞株(INS-1 SGSMS2)、阴性对照细胞株(INS-1 shRNA-NC))作为研究模型,采用细胞免疫荧光技术检测WT小鼠和SMS2-KO小鼠胰岛β细胞GLUT2(glucose transporter 2,葡萄糖转运体 2)和 SNAP25(synaptosomal-associated protein of 25 Kda,突触小体蛋白 25)两种蛋白的表达;利用葡萄糖类似物2-NBDG摄取实验比较两组小鼠胰岛葡萄糖的摄取能力;使用全细胞膜片钳技术检测两组小鼠胰岛β细胞及SMS2差异性表达的稳定INS-1细胞株电刺激下的膜电容变化,间接反映β细胞及INS-1细胞的分泌能力。结果:(1)SMS2-KO 小鼠胰岛葡萄糖(2-NBDG)摄取在 60s、120s、300s、600s、1200s时均低于WT小鼠,有统计学意义;(2)与WT小鼠相比,SMS2-KO小鼠胰岛β细胞GLUT2表达减少,SNAP25表达无变化;(3)与WT小鼠相比,SMS2-KO小鼠胰岛β细胞膜片钳电刺激后细胞Cm1和Cm2均下降(Cm=IRP+RRP),表明其分泌能力减弱(p<0.05);与对照组相比,INS-1 shRNA-SMS2膜片钳电刺激后Cm1和Cm2也显著低于INS-1 shRNA-NC(p<0.05),而INS-1 SGMS2细胞膜电容则无明显变化。结论:SMS2敲除后通过影响胰岛β细胞膜上GLUT2的表达使葡萄糖摄取减少,从而影响胰岛素的分泌,可能与SMS2敲除后细胞膜上SM(sphingomyelin,鞘磷脂)动态平衡失调,影响富含SM的脂筏区域功能有关。另外,SMS2敲除可能通过影响胞内胰岛素囊泡的转运、分泌过程,从而减少胰岛素分泌。