发菜蓝藻光敏色素的鉴定及光化学性质研究

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蓝藻光敏色素(CBCRs)是蓝藻中响应光信号的一类重要光受体。相比水生单细胞蓝藻Synechocystis sp.PCC 6803、多细胞丝状蓝藻Nostoc punctiforme AtCC 29133,以及Anabaena sp.PCC 7120中的蓝藻光敏色素被陆续报道而言,陆生耐旱蓝藻中的这类光受体研究相对较少。本实验以陆生耐旱蓝藻发状念珠藻(俗称发菜)为研究对象,在其全基因组测序完成的基础上,开展了发菜中蓝藻光敏色素的筛选及其光化学性质研究,以期为发菜中涉及光感受的信号转导途径研究提供前期理论基础。通过对发菜基因组生物信息学分析,发现72个含GAF结构域的目的基因,其中大部分含有组氨酸激酶和REC结构域,说明其可能参与光相关的二元信号转导途径。序列分析表明,部分基因与已报道的CBCRs同源性较高,可能为潜在的光受体。再将这72个基因中GAF和PAS结构域片段,分别与异源表达载体构建重组质粒,转入可诱导表达BV,PCB,PEB生色团的三种E.coli LMG194菌株中诱导表达蛋白。通过SDS-PAGE锌染和考马斯亮蓝染色,筛选到10个可以结合生色团的目的蛋白。其中,除Nsfl5654结合BV、PCB和PEB,Nsfl43结合BV和PCB,Nsfl10030结合BV外,其它蛋白均只结合PCB。纯化蛋白光谱扫描显示它们响应的光信号波长范围分布较广,从近紫外到远红光范围的光信号都有响应。同时,这些CBCRs从一种吸收型转换到另一种吸收型的速率各不相同,说明不同CBCRs的光敏感性差异很大,暗示它们在发菜中响应光信号的特征也存在较大差异,发菜中多样的CBCRs感光特性可能与发菜适应多变的外界光环境有一定关联。尿素变性实验结果显示,除 Nsfl5097g1 结合 PVB、Nsfl5654 和 Nsfl10030g3/g4 结合 BV外,其它的色素蛋白结合PCB,除Nsfl10030g3只观察到结合反式BV外,其它色素蛋白结合的生色团有顺反构象的变化。此外,Nsfl43和Nsfl10181的氨基酸序列非常相似,GAF结构域部分仅有21个氨基酸不同,且都有保守的半胱氨酸位点,但Nsfl43可以结合两种生色团并表现出光化学活性,而Nsfl10181则不结合生色团。氨基酸点突变与生色团的结合实验结果表明,Nsfl43是通过保守的第87位和第115位的半胱氨酸与PCB结合,并且第115位的半胱氨酸在这个过程中发挥关键作用。同时我们也将Nsfl10181中6个与Nsfl43不同的位点分别做了点突变,发现Nsfl10181中第132位的苏氨酸突变成脯氨酸后便可以结合PCB,而再将Nsfl43中相同位点的脯氨酸突变成苏氨酸后,便不能结合PCB 了,由此说明,第132位的脯氨酸对于结合生色团有着重要的作用,但其在蛋白结构中的功能还有待进一步研究。
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