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研究背景及意义最新研究显示,颈肩痛,腰腿痛在人群中所占比例正在不断增加,给个人、家庭乃至整个社会带来沉重负担。其发生的主要原因是椎间盘退变性疾病。此类疾病发生的确切机制尚不清楚。在基础研究领域,公认的椎间盘退变主要机制是髓核细胞活力降低,数量减少,细胞外各种各样的基质分泌变少,导致髓核脱水变性,从椎间盘内膨出、突出或者脱出,压迫神经根,加上相应椎间盘高度丢失,生物力学改变,进而引发临床症状。治疗的方案主要有保守治疗和外科手术治疗。虽然近年来外科手术方式已经取得很大进步,在缓解症状的同时能够减少对病人的手术创伤,但其治疗方式仍然属于破坏性治疗而对退变的椎间盘本身并无根本治疗作用,甚至在术后也会出现复发、相邻椎间盘退变加速、脊柱生理曲度改变等问题。为了从根本上治疗椎间盘退变性疾病,专家学者们将目光转移到生物学治疗方法,并已取得众多研究成果。本课题组前期研究发现在对骨髓间充质干细胞和髓核细胞进行非接触式共培养后,干细胞分化为髓核样细胞,可表达髓核细胞的表型。而且髓核细胞表现出较实验前功能更强的趋势。在共培养系统中,细胞间的信息交流主要形式是外泌体,结合外泌体广泛存在的特性。本课题组提出假设,骨髓间充质干细胞能够分泌外泌体,且外泌体有改善退变髓核细胞功能和延缓退变进程的作用。研究方法1.BMSCs的提取及鉴定:1)利用全骨髓法提取SD大鼠骨髓贴壁细胞,用去除外泌体的培养液进行培养及传代;2)对提取的贴壁细胞进行成骨成脂成软骨三系分化诱导鉴定以及流式细胞技术鉴定;2.BMSCs外泌体的收集、提取及鉴定:1)在对已经鉴定成功的BMSCs进行培养和传代的过程中收集培养液上清;2)利用差速离心法对上清液进行离心,对所得沉淀测定浓度后保存备用;3)在透射电镜下对沉淀物质大小和形态特征进行观察;4)对所得沉淀用WB法检测外泌体标志蛋白。3.NPCs的提取及退变模型的建立:1)提取SD大鼠尾NPCs,正常传代扩增备用;2)在显微镜下观察随着传代各代细胞形态变化,选取合适的代系用于后续实验;3)对第二代和第六代进行β-半乳糖苷酶染色后对比。4.退变NPCs摄取BMSCs外泌体的观察:用CM-Dil对BMSCs外泌体进行染色标记,用CM-Dio对退变NPCs进行染色标记,共培养24h后,在激光共聚焦显微镜下观察退变NPCs摄取BMSCs外泌体的情况,并照相记录。5.BMSCs外泌体对退变NPCs的影响:1)本实验设置三组:空白对照组:退变NPCs(P6);共培养组:退变NPCs(P6)与BMSCs(P3)在Transwell系统中培养;外泌体组:退变NPCs(P6)中加入BMSCs外泌体浓度为50μg/ml的培养基诱导;2)诱导培养14d后,观察外泌体组细胞形态学变化以及和P2 NPCs形态学差别;3)诱导培养3d、7d、10d、14d后用PCR法检测三组NPCs标志基因ACAN、COL2、SOX9、TIMP1和MMP1 mRNA的相对表达量,对所得结果进行统计学分析;4)诱导培养3d、7d、10d、14d后用WB法检测三组NPCs标志基因ACAN、COL2、SOX9、TIMP1和MMP1对应蛋白质的表达情况。结果1.通过全骨髓法提取SD大鼠骨髓得到的贴壁细胞:1)细胞为长梭形,细胞密度、大小均匀,呈旋涡状生长;2)流式细胞技术鉴定贴壁细胞干细胞阳性标志物CD29、CD44和CD90分别表达99.8%、95.4%和99.8%,干细胞阴性标志物CD34和CD45分别表达6.16%和6.08%;3)经成骨分化培养后染色,见明显钙结节形成;经成脂分化培养后,见明显脂肪滴形成;经成软骨分化培养后,见明显糖胺聚糖积累;2.差速离心所得沉淀物:1)在透射电镜下观察为直径30-100nm的圆盘状囊泡,大小不均匀;2)WB检测CD63、CD81、Tsgl01高表达,Calnexin未表达;3.从形态学上看,P1和P2 NPCs为短梭状,形态单一。随着代数的增加,细胞渐渐形态不一,传代到P6时,细胞变大,伸出伪足。由于P1中存在较多杂质,故选P2和P6细胞用于后续实验;通过细胞衰老β-半乳糖苷酶染色法染色P6和P2 NPCs,P6NPCs染色颜色程度和染色细胞比例(75%)较P2 NPCs(20%)明显升高;4.在激光共聚焦显微镜下观察到BMSCs外泌体全部被摄取于P6 NPCs内;5.1):外泌体组细胞实验后较实验前体积变小,伪足相对更少,比P2 NPCs体积大;2):ACAN、COL2、SOX9和TIMP1基因mRNA相对表达量在各时相点共培养组较对照组明显升高,而外泌体组较共培养组明显升高(P<0.05),在共培养组和外泌体组组内,随着时间增加,相对表达量逐渐增加(P<0.05);MMP1基因mRNA相对表达量在各时相点共培养组较对照组明显降低,而外泌体组较共培养组明显降低(P<0.05),在共培养组和外泌体组组内,随着时间增加,相对表达量逐渐降低(P<0.05);3):用WB法对ACAN、COL2、SOX9、TIMP1和MMP1基因对应蛋白质进行检测,其结果表现出与PCR结果同样的趋势。结论1、通过全骨髓法提取的贴壁细胞成功鉴定为干细胞;通过差速离心法得到的沉淀成功鉴定为外泌体;2、P6 NPCs较P2NPCs从形态和功能上产生明显退变,成功建立退变模型;3、BMSCs外泌体能够被退变NPCs所摄取并能够改善退变NPCs的形态和功能,本研究为从根本上治疗椎间盘退变性疾病提供了新的思路。