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1,2,4-丁三醇(1,2,4-butanetriol,简称BT)是一种有价值的能源材料1,2,4-三硝酸酯的前体物质,它在高分子材料、农业、烟草、军事、医药多个领域有广泛应用。1,2,4-三硝酸酯由于具有优良热稳定性等诸多优点而成为替代硝化甘油的理想材料。由于常规化学法合成1,2,4-丁三醇具有成本高,反应条件苛刻,副产物多许多弊端,因此,通过生物合成方法,利用木质纤维素原料生产1,2,4-丁三醇已成为资源开发领域的研究热点。本研究就是通过基因工程手段对大肠杆菌进行改造,希望获得能够利用木糖产1,2,4-丁三醇的工程菌株。一方面充分利了用可再生资源木质纤维素,另一方面获得了可以大量生产1,2,4-丁三醇的工程菌株,这对生产具有重要的理论和实践意义。本研究以恶臭假单胞菌(P.putida CICC21884)基因组为模板,通过PCR方法扩增得到苯甲酰甲酸脱羧酶编码基因(mdlC);以枯草芽孢杆菌(B.subtilis 168)基因组DNA为模板,通过PCR方法扩增得到木糖脱氢酶编码基因(gdh),扩增结果显示mdlC基因长度为 1599bp,gdh基因长度为 786bp,经过Genbank比对,显示扩增结果正确。将两个基因同时连接到具有两个多克隆位点的表达质粒pRSFDuet-1上,获得表达质粒pSLQMG,转化至宿主大肠杆菌E.coliJM109(DE3)中,获得阳性重组菌SLQMG3;该菌株在含有40g/L木糖的发酵培养基中进行摇瓶发酵,利用HPLC法检测到1,2,4-丁三醇的生成,产量为0.42g/L,而原始菌株无丁三醇生成。由此可以看出,本实验成功构建了具有苯甲酰甲酸脱羧酶活性和木糖脱氢酶活性的大肠杆菌,疏通了大肠杆菌E.coliJM109(DE3)利用木糖产1,2,4-丁三醇的代谢流。利用正交试验对重组菌株SLQMG3最佳产酶条件进行了优化,摸索出了两种酶的最佳诱导表达条件,确定最优表达条件为IPTG浓度0.5mmol/L、诱导时间8h、诱导温度37℃,并且通过SDS-PAGE测得mdlC基因和gdh基因在宿主菌中正确表达出蛋白,分别为55kD和34kD。至此,目标基因工程菌株初步构建成功,为后续的发酵木糖试验奠定了菌株基础。为了阻断木糖的旁支代谢流,而使得底物木糖更多的流向合成1,2,4-丁三醇,本文利用Red同源重组法敲除大肠杆菌E.coliJM109(DE3)染色体中的两个基因(木酮糖异构酶基因和木酮糖激酶基因xylAB),获得双基因敲除突变株E.coliJM109(DE3)ΔxylAB。将构建好的表达质粒pSLQMG转化至突变菌株E.coliJM109(DE3)ΔxylAB中,获得阳性重组菌SLQMG4。经过摇瓶发酵,HPLC法检测结果发现,以40g/L木糖为底物,SLQMG4的1,2,4-丁三醇产量为0.58g/L,较敲除前重组菌株SLQMG3(1,2,4-丁三醇产量0.42g/L)提高了38%,得率为0.25g/g。本课题研究的成功,对1,2,4-丁三醇高产基因工程菌的构建有一定指导意义。也为大肠杆菌木糖代谢途径的改造提供了新的成功实例,为生物法实现工业化生产1,2,4-丁三醇奠定理论和实践基础。