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桑树是一种重要的经济作物,其根、茎、叶、果实均具有较大的经济价值,且桑叶是家蚕最好的天然饲料,桑树为蚕桑业带来了丰厚的收入。桑树病害的发生严重制约了蚕桑业的发展。桑穿孔病是近些年来才受到关注的一种桑病,该病害的发生严重影响了桑叶产量和品质以及桑树的生长。植物穿孔病主要由病原微生物引起的,感病植物的典型病征表现为叶片穿孔、脱落,同时对枝条和果实也有一定的影响。在2008年有研究报道了桑穿孔病的发生,但桑穿孔病的病因及病原体迄今尚不清楚。2015年8月四川省绵阳市三台县的桑园发生了较大规模的桑树穿孔病,同时还伴有大量微型害虫的危害,这一复杂的生态现象给穿孔病发生的原因的准确诊断增加了难度。本课题组成员于2015年三台县桑园爆发穿孔病时,前往该桑园进行了现场观察和病叶样本的采集,并进一步对受害叶面的微生物进行了分离、纯化和鉴定,对叶面上分布的微型害虫进行了调查和初步分类;根据科赫法则将分离得到的5种疑似病原菌Pantoea agglomerans MB01、Pantoea ananatis MB02、Nigrospora sphaerica MF03、Phomopsis sp.MF05和Epicoccum nigrum MF06回接到健康的桑叶上,以检测疑似病原菌的致病性,将产生穿孔症状的桑叶带回实验室进行病原菌的再分离,并将再分离菌株与3种接种菌株对比分析,确认为桑树穿孔病病原菌。从已验证的3株桑树穿孔病病原菌中选择致病性最强的菌株Nigrospora sphaerica MF03,通过观察其生长周期和温度、pH值、光照条件这三种因素对菌丝生长的影响以及测试菌丝的致死温度来研究菌株的生物学特性。本文的主要研究内容和实验结果如下:1病叶表面微生物的分离鉴定及微型害虫调查根据植物病原微生物的常规分离方法,从桑叶病斑组织分离到了若干菌株,再根据16S或者ITS鉴定为5株细菌,6株真菌。通过对16S rDNA或ITS rDNA基因片段的扩增与测序并构建系统发育树,同时结合形态特征将分离到的细菌菌株分别鉴定并命名为:Pantoea agglomerans MB01、Pantoea ananatis MB02、Pseudomonas oryzihabitans MB03、Pseudomonas argentinensis MB04以及Acinetobacter calcoaceticus MB05;分离到的真菌菌株分别鉴定并命名为:Nigrospora sp.MF01、Nigrospore oryzae MF02、Nigrospora sphaerica MF03、Phanerochaete sordid MF04、Phomopsis sp.MF05和Epicoccum nigrum MF06。此外,本实验中还观察到在病桑叶表面分布着大量的微型害虫,经过统计、调查,可将它们初步鉴定为桑蓟马、桑粉虱、叶螨和叶甲。2疑似病原菌的致病性试验结合文献资料,本研究从分离得到的菌株中选择2株疑似植物致病性细菌:Pantoea agglomerans MB01、Pantoea ananatis MB02以及3株真菌:Nigrospora sphaerica MF03、Phomopsis sp.MF05和Epicoccum nigrum MF06进行科赫试验,将疑似病原菌回接到健康的桑叶表面以检测分析。结果显示,细菌分离株没有引起桑叶发病;而真菌试验分为桑叶创伤和无创伤两种处理,3株真菌接种无创伤处理的桑叶后,虽能低频率地感染桑叶使其产生病斑但均不产生穿孔症状;3株真菌接种创伤处理的桑叶后均能引起桑叶产生典型的穿孔症状,且以菌株Nigrospora sphaerica MF03的致病性最高,在夏秋两季接种桑叶都能引起非常高的穿孔率。另外两株真菌Phomopsis sp.MF05和Epicoccum nigrum MF06在夏季接种桑叶能引发非常高的穿孔率,而在秋季接种桑叶仅能引起桑叶发生病斑却不能出现穿孔现象。同时对接种后产生典型穿孔症状的桑叶进行病原菌的再分离,并将再分离的菌株的ITS rDNA序列、形态特征分别与原接种菌株对比,比较分析结果表明再分离菌株与原接种菌株一致。因此综合以上研究结果可确定这3株真菌Nigrospora sphaerica MF03、Phomopsis sp.MF05和Epicoccum nigrum MF06均能引起桑叶穿孔。3致病性菌株Nigrospora sphaerica MF03的生物学特性研究基于致病性试验结果,选择致病性最高的真菌菌株Nigrospora sphaerica MF03为目的菌株并进一步研究该菌株的生物学特性,以期为桑叶穿孔病的防治提供基础数据与参考。通过检测菌株的生长周期和温度、pH值、光照条件对菌丝生长的影响以及测定菌丝的致死温度,研究结果显示在实验室条件下未观察到菌株Nigrospora sphaerica MF03的有性生殖周期,初步确定该菌通过孢子进行繁殖的。菌丝对生长温度、pH值表现出较大的耐受范围,但培养温度高于35℃或pH值小于2.0时菌丝不能生长;且菌丝生长不依赖光照,其致死温度为50℃。