【摘 要】
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目的1.证明超速离心法可以获取支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid,BALF）源性外泌体。2.获得组间差异性表达的外泌体miRNA。3.完成组间差异miRNA的GO富集分析和KECG富集分析,同时完成差异miRNA靶基因关系预测结果的初步研究。方法1.收集住院患者的支气管肺泡灌洗液,超速离心法提取外泌体,根据纳排标准将样本分为肺腺癌组、肺鳞癌组和对照组。2.使
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目的1.证明超速离心法可以获取支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid,BALF）源性外泌体。2.获得组间差异性表达的外泌体miRNA。3.完成组间差异miRNA的GO富集分析和KECG富集分析,同时完成差异miRNA靶基因关系预测结果的初步研究。方法1.收集住院患者的支气管肺泡灌洗液,超速离心法提取外泌体,根据纳排标准将样本分为肺腺癌组、肺鳞癌组和对照组。2.使用3种方法完成外泌体鉴定,即透射电镜进行形态学观察,纳米颗粒跟踪分析仪（Nanoparticle Tracking Analysis,NTA）测定粒径大小及免疫印迹（Western Blot,WB）检测外泌体特异性蛋白。3.完成外泌体总RNA样本的提取及质控,建立测序文库并进行二代基因测序并完善质量控制结果。4.生物信息软件分析得到组间差异miRNA及其生物学功能。结果1.超速离心法成功提取到BALF源性外泌体,透射电镜观察到典型的杯托状双层膜结构,60%以上粒子直径在30-150nm之间,WB实验证明每组样本均含有外泌体标记性蛋白（CD9、CD63和CD81）,条带浓度显示到对照组外泌体浓度低于肺癌组。2.三次重要的质量控制结果符合样本要求,即外泌体的质量总RNA样本的质量控制、测序文库的质控和外泌体miRNA测序数据的质控。3.筛选出组间差异表达的miRNA。肺腺癌组4种miRNA显著下调,即hsa-let-7b-5p,hsa-miR-92b-5p,hsa-miR-200c-3p和hsa-miR-27b-3p;肺鳞癌组6种miRNA显著上调,即hsa-miR-200c-3p,hsa-miR-143-3p,hsa-miR-532-5p,hsa-miR-27b-3p,hsa-miR-891a-5p和hsa-let-7g-5p。4.组间差异miRNA的GO富集分析获得三个层面的功能注释。肺腺癌组下调的差异性miRNA涉及的生物学过程（Biological Process,BP）包括神经元投射导向、细胞形态分化的正向调控以及轴突生成的调控等方面,细胞组分（Cellular Component,CC）包括突触后致密物质、不对称突触、谷氨酸能突触等,分子功能（Molecular Function,MF）包括蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性。肺鳞癌组上调的差异性miRNA涉及的BP包括组织细胞投影的正向调控、MAPK级联反应和应激活化的蛋白激酶信号级联反应等功能,CC包括细胞边缘、神经元至神经元突触及胶原三聚体等,MF包括小G蛋白的结合和蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性。5.KEGG数据库获取差异性miRNA的代谢通路信息。肺腺癌组下调的miRNA主要涉及的信号通路为MAPK信号通路和癌症相关通路,肺鳞癌上调miRNA涉及的通路主要为糖代谢途径和单纯疱疹病毒感染的信号通路。6.组间差异miRNA靶基因关系预测结果,NEK8、NOTCH2NL、ZNF28等基因是值得被研究的靶基因。结论1.外泌体可以从肺泡灌洗液中通过超速离心法分离提取,通过电镜、NTA和WB的鉴定结果证实可以满足后续实验要求。2.样本高通量测序的miRNA结果质量评估符合要求,火山图和聚类分析显示各样本miRNA相似性和差异性。3.筛选出10个组间显著差异表达的miRNA,完成GO富集分析、KECG通路分析和靶基因预测。
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