米糠抗氧化肽的酶法制备及其特性研究

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我国米糠资源丰富,米糠富含脂肪、蛋白质等多种营养成分。米糠蛋白具有很高的营养价值,是一种优质的植物蛋白。米糠中蛋白质的低溶出率限制了米糠蛋白在食品行业中的应用。本文以脱脂米糠为原料,采用酶水解工艺制备米糠抗氧化肽,以体外抗氧化性为目标优化米糠蛋白酶解工艺,随后初步表征米糠蛋白酶解物的构效关系,最后研究米糠抗氧化肽在冷却猪肉保鲜中的应用。本文首先以水解度与羟基自由基清除能力为指标,比较碱性蛋白酶、中性蛋白酶、酸性蛋白酶酶解脱脂米糠蛋白水解物的抗氧化效果,结果表明酸性蛋白酶对米糠蛋白酶解效果较好且制备的抗氧化肽活性较高。当pH为4,温度45℃、底物浓度为0.5%,酶底比为0.5%,酶解时间2h时,水解度可达14.52%,其酶解产物的羟基自由基清除率为74.9%,均高于其他两种酶。以酸性蛋白酶为水解酶,以羟基自由基清除能力为指标,首先采用单因素实验优化酶水解的底物浓度、pH值、温度、酶底比,接着采用正交实验进一步优化酶解工艺参数,得到酸性蛋白酶酶解米糠蛋白制备抗氧化肽的最佳工艺条件为:pH4,温度45℃,酶底比0.5%,底物浓度5%,酶解时间3h。同时,研究表明:酶解产物的抗氧化活性与水解度总体上不呈正相关关系。本文接着以抗坏血酸为对照,以超氧自由基清除能力、羟基自由基清除能力、过氧化氢清除能力以及还原能力表征碱性蛋白酶、中性蛋白酶与酸性蛋白酶酶解脱脂米糠制备米糠蛋白酶解液的体外抗氧化活性。研究结果显示:三种蛋白酶制备的米糠蛋白酶解液均表现出较强的抗氧化性,但抗氧化效果远不及同浓度下的抗坏血酸。碱性蛋白酶制备的米糠蛋白酶解液清除超氧阴离子能力优于其他酶解产物,碱性蛋白酶酶解1h,超氧自由基清除率可达98.41%,IC50值(清除率为50%所对应的浓度)达到1.08mg/mL;酸性蛋白酶制备的米糠蛋白酶解液清除羟基自由基能力最强,最高达到77.08%。本文还以内源荧光光谱、表面疏水性、巯基含量、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)以及凝胶过滤层析初步探讨米糠抗氧化肽的构效关系。结果显示:在酶解反应的过程中,随着酶解时间的延长以及水解度的提高,酶解物的内源荧光最大峰位逐渐增大,说明米糠蛋白结构在酶解过程中逐渐发生了去折叠变化;在酶解过程中,其表面疏水性指数呈现先下降后上升的趋势,结合抗氧化能力推测酶解物结构内部的疏水性基团与抗氧化能力有一定联系;巯基含量一直处于较低水平,酶解过程促使米糠蛋白巯基氧化。SDS-PAGE结果表明米糠蛋白酶解物主要是分子量低于10kDa的肽,进一步使用葡聚糖凝胶Sephadex G-25分离获得了具有较高清除DPPH和超氧阴离子能力的组分,清除率超过90%。研究的最后将抗氧化性较强的米糠蛋白酶解物运用于冷却猪肉的保鲜中,通过测定冷却猪肉在贮藏期间的感官指标、理化指标和微生物指标来评价米糠蛋白酶解产物的保鲜效果。结果表明:贮藏过程中,米糠蛋白酶解物在保持冷却猪肉色泽、风味、粘度及弹性方面均有较好的效果,对抑制肉样在贮藏中脂质过氧化中间产物的产生有显著作用,并且在整个贮藏期间能使酸价保持在较低水平,同时减缓肉样在贮藏过程中的pH值上升。不过,从微生物指标来看,米糠蛋白酶解物的抗菌性效果不明显。其中,经Sephadex G-25分离纯化后的酶解物组分保鲜效果最佳。
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