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背景和目的食管鳞癌（esophageal squamous cell carcinoma,ESCC）是恶性程度高,致死性强的消化道肿瘤之一。目前,ESCC发病机制有待进一步阐明。葡萄糖转运蛋白1（glucose transporter 1,Glut1）是一类负责将胞外葡萄糖转运至胞内的膜转运蛋白,参与许多肿瘤糖酵解过程。研究表明,Glut1在多种肿瘤中过表达,并可能成为肿瘤潜在的诊断和预后的分子标记,靶向抑制Glut1的表达可能成为肿瘤治疗的新策略。许多研究显示,Glut1抑制剂WZB117、BAY-876和Phloretin在许多肿瘤中具有良好的抗肿瘤效果,但在ESCC中的作用尚需进一步探讨。本研究的目的是从体内外探讨Glut1抑制剂WZB117、BAY-876和Phloretin在ESCC中的抗肿瘤作用,并初步剖析其可能的分子机制,以期为ESCC患者的靶向治疗提供实验依据。第一部分葡萄糖转运蛋白抑制剂体外抗食管鳞癌的作用及其分子机制方法1.CCK-8、Ed U和克隆形成实验检测不同浓度的WZB117、BAY-876和Phloretin在不同时间点（24 h、48 h、72 h和96 h）对ESCC细胞（Eca109、EC9706和KYSE70）增殖的影响。2.流式细胞术检测不同浓度的WZB117、BAY-876和Phloretin处理72 h后ESCC细胞凋亡;细胞划痕和Transwell实验检测不同浓度的WZB117、BAY-876和Phloretin处理72 h后ESCC细胞的迁移和侵袭。3.葡萄糖和乳酸测定试剂盒检测不同浓度的WZB117、BAY-876和Phloretin处理72 h后ESCC细胞的葡萄糖吸收和乳酸生成;Western blot检测不同浓度的WZB117、BAY-876和Phloretin作用72 h后ESCC细胞糖酵解途径相关蛋白的表达。4.采用Illumina高通量测序平台,2×150 bp双端测序策略对BAY-876（0.5μM）和Phloretin（110μM）处理72 h后的EC9706细胞进行全转录测序,通过火山图和热图展示m RNA差异表达,利用GO和KEGG分析差异表达基因的功能及相关信号途径。5.统计学分析:数据采用Graph Pad Prism 8.0统计学软件分析。数据表示为平均值±标准差（mean±standard deviation）。对于服从正态分布和方差齐性的两组样本的均数比较采用Student’s t检验,反之采用Mann-Whitney U非参数检验;三组及以上比较采用One-way ANOVA分析,对于服从正态分布和方差齐性的三个样本均数之间的两两比较采用LSD检验,三个以上样本均数的两两比较采用Bonferroni test分析,对于不服从正态分布和方差齐性的多个样本均数的两两比较采用Kruskal-Wallis检验。P<0.05表示具有统计学差异。结果1.CCK-8结果表明,WZB117、BAY-876和Phloretin均能抑制ESCC细胞的增殖,且均具有时间和剂量依赖性,在72 h的抑制效果最佳;Ed U实验结果表明,随着浓度的增加,ESCC细胞的增殖率降低;克隆形成实验结果表明,随着抑制剂浓度的增加,克隆形成能力显著降低。2.细胞凋亡、细胞划痕和Transwell实验结果表明,WZB117、BAY-876和Phloretin均能诱导ESCC细胞凋亡,抑制迁移和侵袭。3.葡萄糖和乳酸测定结果表明,WZB117、BAY-876和Phloretin均能抑制ESCC细胞的葡萄糖摄取和乳酸生成,其中BAY-876作用效果最佳;Western blot结果表明,WZB117、BAY-876和Phloretin导致Glut1、HK2、PFKM、PKM2、LDHA、PDK1、HIF-1α和c-Myc蛋白表达显著下调。4.全转录组测序结果表明,BAY-876处理EC9706细胞后产生223个差异表达基因,其中63个上调,160个下调,这些差异基因参与TNF途径、TGFβ途径和PI3K-AKT途径等的调控。Phloretin处理EC9706细胞后产生507个差异表达基因,其中241个上调,266个下调,这些差异基因参与PI3K-AKT途径、Erb B途径、Ras途径、Wnt途径和JAK-STAT途径等的调控。第二部分BAY-876联合DMOG在ESCC中的抗肿瘤作用及其分子机制方法1.实验分组:对照组、BAY-876单独处理组、DMOG单独处理组和DMOG与BAY-876联合组。2.CCK-8检测不同处理组中ESCC细胞Eca109、EC9706及KYSE70在48 h的增殖能力。3.qRT-PCR和Western blot检测不同处理组ESCC细胞中Glut1、SEMA5B和HIF-1αm RNA和蛋白的表达。4.裸鼠移植瘤实验:在裸鼠皮下接种EC9706细胞,设置生理盐水组、BAY-876单独治疗组、DMOG单独治疗组以及BAY-876与DMOG联合治疗组,每两天治疗肿瘤并测量移植瘤体积大小,用Graph Pad Prism 8.0软件绘制肿瘤生长曲线。治疗结束后,处死裸鼠,剥离肿瘤组织,qRT-PCR和Western blot检测肿瘤组织中Glut1、SEMA5B和HIF-1αm RNA和蛋白的表达。5.统计学分析:数据采用Graph Pad Prism 8.0统计学软件分析。数据表示为平均值±标准差（mean±standard deviation）。对于服从正态分布和方差齐性的两组样本的均数比较采用Student’s t检验,反之采用Mann-Whitney U非参数检验;三组及以上比较采用One-way ANOVA分析,对于服从正态分布和方差齐性的三个样本均数之间的两两比较采用LSD检验,三个以上样本均数的两两比较采用Bonferroni test分析,对于不服从正态分布和方差齐性的多个样本均数的两两比较采用Kruskal-Wallis检验。P<0.05表示具有统计学差异。结果1.CCK-8结果显示,BAY-876组显著抑制ESCC细胞增殖,DMOG组中ESCC细胞增殖与对照组相比无差异,但BAY-876与DMOG联合组中ESCC细胞的抑制效果最为显著,差异具有统计学意义（P<0.05）。2.qRT-PCR和Western blot结果表明,与对照组相比,BAY-876显著下调Glut1、SEMA5B和HIF-1αm RNA和蛋白的表达;DMOG导致Gut1、SEMA5B和HIF-1αm RNA和蛋白表达显著上升;BAY-876与DMOG联合组中ESCC细胞中Glut1、SEMA5B和HIF-1αm RNA和蛋白表达下调最为显著（P<0.05）。3.裸鼠皮下移植瘤结果表明,对照组与DMOG治疗组中移植瘤的生长无差异,但BAY-876治疗组显著抑制裸鼠移植瘤的生长,BAY-876与DMOG联合组中移植瘤抑制效果最为显著（P<0.05）。qRT-PCR和Western blot结果表明,与对照组相比,BAY-876治疗显著抑制Glut1、SEMA5B和HIF-1αm RNA和蛋白的表达;DMOG治疗显著促进Glut1、SEMA5B和HIF-1αm RNA和蛋白的表达;BAY-876与DMOG联合治疗组中Glut1、SEMA5B和HIF-1αm RNA和蛋白表达下调最为显著（P<0.05）。结论1.WZB117、BAY-876和Phloretin抑制ESCC细胞的增殖,迁移和侵袭,诱导细胞凋亡,并且显著下调糖酵解相关蛋白的表达,提示靶向Glut1可能成为ESCC新的治疗策略。2.全转录组测序以及体内外实验结果表明SEMA5B可能是BAY-876抑制剂在ESCC中发挥抗肿瘤作用的潜在分子靶点。