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系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)是一种复杂的自体免疫性疾病,几乎影响身体各个器官,其中沉积在肾脏的自身抗体及免疫复合物(immune complexes,IC)能触发炎症反应,导致狼疮肾炎(lupus nephritis,LN),可发展至终末期肾病[1]。LN的发病机制尚不明确。目前LN的治疗主要依靠激素和免疫抑制剂。长期使用激素可引起诸如高血压、血糖升高、诱发感染、骨质疏松等不良反应。而使用免疫抑制剂可出现骨髓抑制、肝肾损害等副作用。因此,探讨狼疮肾炎的发病机制有助于探寻疗效确切、副作用小的治疗手段。内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)是否参与到LN的发病机制尚未明确,本研究通过观察MRL/lpr小鼠内质网应激现象、利用4-苯基丁酸(4-phenyl butyric acid,4-PBA)抑制ERS,观察其变化,探讨LN的发病机制,有助于为LN的治疗提供新思路。一、材料和方法1.小鼠狼疮肾炎模型及干预方案选用12周龄的雌性MRL/lpr小鼠共16只,随机分为4-PBA干预组和溶媒对照组,每组8只。同时选取8只12周龄雌性健康小鼠作为正常对照组。4-PBA干预组小鼠给予1.0 g.kg-1.d-1剂量的4-PBA灌胃。正常对照组和溶媒对照组则分别给予等体积生理盐水灌胃。治疗前及治疗过程中第4、8和12周检测24小时尿蛋白定量;第12周检测血肌酐(SCr)和尿素氮(BUN)。2.组织学损伤评估肾组织石蜡切片行HE、PAS染色,观察肾小球、肾小管及肾血管病理损害情况。3.免疫组织化学染色及量化肾组织石蜡切片行免疫组化染色观察肾小球、肾间质及肾血管周围CD3+T细胞浸润情况。4.RT-PCR检测mRNA表达提取肾脏组织总RNA,以GAPDH作为内参照,检测GRP78、CHOP、PERK、eIF2α、ATF4、IRE1α、XBP1、ATF6 mRNA 表达,计算目标条带与内参照条带密度的比值。5.Western blot检测蛋白表达提取肾脏组织总蛋白,以GAPDH作为内参照,检测GRP78、CHOP、p-PERK、p-eIF2α、ATF4、p-IRE1α、XBP1、ATF6 蛋白表达。提取肾脏组织的核蛋白,以Fibrillarin作为内参照,检测核内NF-κB p65表达,计算目标条带与内参照条带密度的比值。6.ELISA提取肾脏组织匀浆的上清液,利用ELISA检测上清液MCP-1、TNF-α、IL-6水平。7.统计学分析组间均数的比较使用方差分析(ANOVA),两两比较采用LSD-t检验,p<0.05证明存在统计学差异。二、结果1.MRL/lpr小鼠LN中的ERS现象与正常小鼠相比,MRL/lpr小鼠肾脏中ERS相关标志物GRP78 mRNA及GRP78蛋白的表达明显升高(p<0.05),且ERS信号通路PERK和IRE1α的磷酸化蛋白表达也明显升高(p<0.05)。2.MRL/lpr小鼠蛋白尿变化情况MRL/lpr小鼠在12周龄开始出现蛋白尿,与正常对照组小鼠比较,溶媒对照组小鼠的24小时尿蛋白定量明显增多(p<0.05);在4-PBA干预12周后,4-PBA干预组小鼠的24小时尿蛋白排泄量显著低于溶媒对照组(p<0.05)。3.MRL/lpr小鼠血生化变化情况与正常对照组比较,溶媒对照组小鼠的血BUN和SCr均显著升高(p<0.05);4-PBA干预12周后,4-PBA干预组小鼠的血BUN及SCr显著低于溶媒对照组(p<0.05)。4.MRL/lpr小鼠肾脏组织学变化情况与正常对照组比较,溶媒对照组小鼠肾小球、肾小管间质及肾血管评分均明显增加(p<0.05);4-PBA干预12周后,4-PBA干预组小鼠的肾脏组织评分显著低于溶媒对照组(p<0.05)。5.MRL/lpr小鼠肾脏炎症细胞浸润情况与正常对照组比较,溶媒对照组小鼠的肾组织CD3+T淋巴细胞浸润明显增多(p<0.05);4-PBA干预12周后,4-PBA干预组CD3+T淋巴细胞浸润程度较溶媒对照组显著减轻(p<0.05)。6.MRL/lpr 小鼠肾脏 GRP78、CHOP、PERK、eIF2α、ATF4、IRE1α、XBP1、ATF6mRNA 表达情况RT-PCR结果显示,与正常对照组比较,溶媒对照组小鼠的GRP78、CHOP、PERK、eIF2α、ATF4、IRE1α、XBP1、ATF6mRNA 表达水平均显著升高(p<0.05);4-PBA干预12周后,4-PBA干预组以上指标较溶媒对照组显著降低(p<0.05)。7.MRL/lpr 小鼠肾脏 GRP78、CHOP、p-PERK、p-eIF2α、ATF4、p-IRE1α、XBP1、ATF6蛋白表达情况Western blot结果显示,与正常对照组比较,溶媒对照组小鼠的GRP78、CHOP、p-PERK、p-eIF2α、ATF4、p-IRE1α、XBP1、ATF6 蛋白表达水平均显著升高(p<0.05);4-PBA干预12周后,4-PBA干预组以上指标较溶媒对照组显著降低(p<0.05)。8.MRL/lpr小鼠肾脏MCP-1、TNF-α、IL-6蛋白表达情况ELISA结果显示,与正常对照组比较,溶媒对照组小鼠的肾组织匀浆MCP-1、TNF-α、IL-6含量均显著升高(p<0.05);4-PBA干预12周后,4-PBA干预组以上指标较溶媒对照组显著降低(p<0.05)。9.MRL/lpr小鼠肾脏NF-κB活化情况Western blot结果显示,与正常对照组比较,溶媒对照组小鼠肾脏核蛋白表达量均显著升高(p<0.05);4-PBA干预12周后,4-PBA干预组肾脏核蛋白表达量较溶媒对照组显著降低(p<0.05)。三、小结本研究发现在MRL/lpr小鼠中存在ERS,使用ERS抑制剂4-PBA进行干预:1.减少MRL/lpr小鼠尿蛋白的排泄,改善肾功能;2.减轻肾脏病理损害;3.抑制肾脏炎症细胞浸润;4.抑制肾脏NF-κB活化;5.减少促炎症细胞因子MCP-1、TNF-α、IL-6的表达;6.抑制ERS状态。结论本研究发现在小鼠LN中:1.ERS参与小鼠LN的发病;2.ERS参与小鼠LN的发病机制可能与NF-1κB炎症信号通路活化有关;3.抑制ERS可减轻肾脏炎症反应及肾脏损害。