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背景慢性乙型肝炎（Chronic hepatitis B,CHB）是由乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）感染引起的慢性肝脏疾病。据估计,全球有30%的人口感染HBV,其中有3.5亿为HBV携带者,每年约有100万人死于与CHB相关的疾病。此外,由于人们饮食和生活方式的改变,导致代谢综合征和肥胖的全球范围流行,伴随着非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD）的患病率以惊人的速度增加。我们前期发表在《柳叶刀 胃肠肝脏病》杂志的研究分析表明,亚洲人群NAFLD患病率为29.62%。随着NAFLD发病率的增加,CHB合并NAFLD患者的数量也明显上升,高达32.8%。CHB合并NAFLD与肝硬化、肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）和肝脏疾病相关死亡率的高风险相关。目前关于肝脂肪变性（Hepatic steatosis,HS）对CHB影响的临床研究结果存在矛盾。有研究认为HS促进CHB肝脏疾病的进展,与单纯CHB患者相比,合并HS的CHB患者坏死性炎症和纤维化明显增加。相反,一些研究认为HS抑制CHB肝脏疾病的进展,表现在慢性HBV感染的NAFLD患者比CHB患者的HBV DNA复制水平降低,肝硬化和HCC的风险降低,HBsAg血清清除率升高。此外,许多临床研究未发现HS与CHB患者疾病严重程度之间存在相关性。而且,对于HS对CHB的影响目前大部分是临床研究,在肝细胞中HS对HBV的具体分子机制尚不清楚。有研究证实 RNA 腺苷脱氨酶 1（Adenosine deaminase acting on RNA 1,ADAR1）作为RNA编辑酶,可通过可变剪接实现对RNA的转录后修饰,参与D型肝炎病毒（Hepatitis D virus,HDV）、丙型肝炎病毒（hepatitis c virus,HCV）与 HCC 的调控。像mRNA一样,miRNA也受到ADAR1的转录后修饰,其中miR-122-5p是成人肝脏中最丰富的miRNA,已成为脂质代谢和病毒复制等其他病理条件的重要转录后调节因子,并显示为CHB或丙型肝炎（chronic hepatitis C,CHC）、NAFLD和药物性肝病的肝脏损害生物标志物。既往研究表明miR-122对HBV表达有抑制作用。因此,我们推测miR-122可能会受ADAR1的调控,从而参与HBV DNA的复制。目的本研究旨在通过细胞实验和人体肝脏组织的验证,研究ADAR1在CHB合并NAFLD中的作用及调控机制,为CHB合并NAFLD的诊断和治疗提供新的分子靶标和理论基础。方法1.探究ADAR1和miR-122在肝组织中的表达收集山东省立医院本院区CHB和CHB合并NAFLD患者肝穿刺的组织各18例,通过qRT-PCR和western blot实验检测ADAR1在CHB合并NAFLD和CHB患者肝脏组织中的表达;通过免疫组织化学染色（immunohistochemical,IHC）实验检测ADAR1在CHB合并NAFLD和CHB患者肝组织中的表达差异。通过qRT-PCR检测miR-122在CHB合并NAFLD和CHB患者肝组织中的表达水平。2.构建高脂合并HBV感染的细胞模型棕榈酸（palmitic acid,PA）刺激的HepG2.2.15细胞作高脂环境中HBV复制的细胞模型。采用CCK-8和油红O染色确定最佳PA浓度。3.检测 HepG2.2.15 细胞上清 HBVDNA、HBeAg、ALT 和 AST 的表达分别检测PA处理组和HepG2.2.15组细胞上清的HBVDNA、HBeAg、ALT和AST的表达水平。4.探究ADAR1和miR-122在HepG2.2.15细胞中的表达qRT-PCR和western blot检测PA处理组和HepG2.2.15组细胞ADAR1的表达差异,qRT-PCR检测miR-122的表达。5.探究ADAR1对HBV DNA复制的影响我们构建过表达和低表达ADAR1慢病毒载体转染HepG2.2.15细胞,过表达或低表达ADAR1,qRT-PCR和western blot验证转染效率。再加用PA刺激,qRT-PCR检测miR-122的变化,同时检测细胞上清HBV DNA的变化。6.探究miR-122对HBV DNA复制的影响用 miR-122 mimics 和 inhibitor 转染 HepG2.2.15 细胞,过表达和低表达 miR-122,再加PA刺激,qRT-PCR检测转染效率,检测细胞上清HBV DNA的变化。7.探究ADAR1的下游作用分子通过全转录组测序和生物信息学技术分析HepG2.2.15细胞中ADAR1低表达前后下游基因的差异表达。结果1.CHB合并NAFLD患者肝组织中HBeAg蛋白表达明显升高,脂肪空泡明显增加,同时ADAR1蛋白、mRNA和miR-122表达较CHB患者明显下调。2.PA浓度在0.5mM时细胞活性不受影响,且脂滴积聚明显。PA处理组的HBVDNA、HBeAg、ALT 和 AST 的表达明显高于 HepG2.2.15 组,ADAR1 蛋白、mRNA和miR-122比HepG2.2.15组明显降低。3.相较于对照组,转染ADAR1过表达慢病毒后,miR-122表达升高,细胞上清的HBV DNA和HBeAg的表达水平均下降;而转染ADAR1低表达慢病毒,趋势则与过表达时相反。4.转染 miR-122 mimics 过表达 miR-122 后,HBVDNA 和 HBeAg 表达均下降,转染miR-122 inhibitor低表达miR-122后,HBVDNA和HBeAg表达升高。5.基于RNA-seq数据,筛选出HepG2.2.15细胞中ADAR1低表达前后的差异表达基因1473个,主要参与谷胱甘肽代谢、胆固醇代谢、肿瘤中的转录失调等途径。进一步筛选出25个关键功能基因,主要参与核糖体途径,病毒感染、NF-kappaB信号、Wnt信号通路等途径。结论CHB合并NAFLD患者肝组织中ADAR1蛋白、mRNA和miR-122表达较CHB患者明显下调。在PA处理的HepG2.2.15细胞中,ADAR1可通过上调miR-122的水平抑制HBV DNA的复制。因此,ADAR1可能成为CHB合并NAFLD的潜在生物标志物和治疗靶点。对HepG2.2.15和HepG2.2.15 ADAR1敲除组进行全转录组测序,通过生物信息学分析筛选出25个核心差异功能基因,这些基因主要涉及核糖体途径、病毒感染、NF-kappaB、Wnt信号通路等。提示ADAR1可能通过影响这些途径调控HBV的表达,为进一步研究ADAR1的具体机制奠定了理论基础。