目的脑损伤是法医学鉴定工作中常见的损伤类型。脑损伤机制、形成时间和程度判断一直受法医学工作者重视,其中脑损伤形成时间推断对刑事案件侦查具有重要意义,然而准确地推断脑损伤时间一直是法医学鉴定中的难题。本实验应用免疫组织化学染色、Western blot方法检测大鼠局灶性脑损伤后钙激活中性蛋白酶1和2(calpain1和calpain2)表达情况,研究calpain1和calpain2在脑损伤修复过程中所起的作用,并对calpain1和calpain2表达变化的时间规律在推断脑损伤形成时间方面的应用性进行了探讨。实验材料与方法一、动物模型的制作,分组与对照雄性Sprague-Dawley大鼠50只,体重200～250g。随机分为10组,每组5只,其中8组为实验组,1组为对照组,1组为假手术组。动物模型采用本课题组研制的大鼠脑损伤分级自由落体打击模型,造成大鼠局灶性脑损伤。大鼠称重后,乙醚吸入预麻醉,2%戊巴比妥钠(30mg/kg)腹腔注射麻醉。正中切开大鼠顶部头皮,在人字缝前3mm、矢状缝旁3mm处钻直径为5mm的圆形骨窗,保持硬脑膜完好。采用自由落体打击装置,以30g重锤从25cm高处落下,打击暴露的脑组织。分别于伤后15min、12h、24h、3d、5d、7d、10d和15d将大鼠麻醉后脱颈椎处死,取出整脑。以损伤灶为中心冠状切开,以备HE染色、免疫组化染色和Westernblot检测应用。假手术组仅行颅骨钻孔开窗,未打击。对照组及假手术组,以同样方法取相同部位的脑组织作为对照。二、免疫组织化学染色脑组织经4%多聚甲醛/PBS pH7.4固定液固定后,水洗,梯度酒精脱水,二甲苯透明,石蜡包埋,制作5μm厚度切片。采用链霉素-生物素法(SP法)进行免疫组化染色,并用苏木素复染细胞核,具体步骤同试剂盒说明书。calpainl或calpain2抗体1:400稀释,4℃孵育过夜。染色过程中另以PBS替代一抗,作为空白对照。兔抗大鼠calpain1多克隆抗体购于Abcam公司,兔抗大鼠calpain2抗体购于Sigma-Aldrich公司,SP免疫组织化学试剂盒与DAB显色剂购于福州迈新生物技术开发有限公司。使用Motic Images Advanced 3.2软件对calpain1和calpain2免疫组化染色阳性反应物面积百分比及平均光密度值进行检测,统计分析。三、Western blot检测提取脑组织蛋白并进行蛋白定量,聚丙烯酰胺凝胶电泳,半干法转印,5%脱脂牛奶封闭,一抗(1:1000稀释)、二抗(1:2500稀释)孵育后,DAB显色。以GAPDH为内参。应用Fluorchem V 2.0 Stand Alone软件获取感光条带的平均灰度值,进行统计分析。实验结果一、免疫组织化学染色结果对照组及假手术组脑组织均有calpain1和calpain2阳性表达。大鼠局灶性脑损伤后,损伤周边区calpain1表达:阳性染色面积及强度于伤后逐渐增强,至伤后12h达高峰,伤后24h阳性染色逐渐减弱,伤后5d阳性表达再次增强,达另一高峰,伤后7d、10d阳性表达逐渐减弱,至15d接近对照组水平。损伤周边区calpain2表达:阳性染色面积及强度于伤后逐渐增强,至伤后12h达高峰,伤后24h阳性表达逐渐减弱,伤后5d表达再次增强,伤后7d、10d阳性表达减弱,至15d阳性表达接近对照组。二、Western blot结果以标准分子量Marker做指示,calpain1在80kDa和58kDa处显示阳性谱带,calpain2在80kDa处显示阳性谱带,GAPDH在36kDa处显示阳性谱带。Western blot结果显示大鼠局灶性脑损伤后calpain1和calpain2蛋白的感光条带在浓度及宽度上存在变化,其平均灰度值的变化具有一定的时间规律性并与免疫组织化学的结果相一致。结论本实验采用大鼠脑损伤分级自由落体打击模型,应用免疫组织化学染色、Western blot方法检测大鼠脑损伤后calpain1和calpain2表达情况,结果表明:1、正常大鼠脑组织中calpain1和calpain2均有表达,大鼠局灶性脑损伤后,损伤周边区calpain1和calpain2的表达随时间而呈现一定的变化规律,且呈较明显的双峰模式。2、calpain1和calpain2的此种时间规律性变化可用于脑损伤形成时间的推断。3、calpain1和calpain2的此种时间规律性变化提示我们可以将calpain1和calpain2病理性激活作为基础进一步研究脑损伤后继发性损伤的分子病理学机制。