论文部分内容阅读
目的:钩端螺旋体病（leptospirosis，简称钩体病）是全球性人畜共患传染病，其主要病原体是致病性钩端螺旋体（简称钩体），其中问号钩端螺旋体（Leptospira interrogans，简称问号钩体）黄疸出血群赖型在我国的流行最广。已有研究表明，问号钩体黄疸出血群赖型赖株（简称问号钩体赖株）在感染过程中可引起宿主巨噬细胞凋亡，但其分子机制尚不清楚。 方法:采用共聚焦显微技术、透射电镜技术确认小鼠单核-巨噬样细胞J774A.1和经佛波酯诱导的人巨噬细胞THP-1对问号钩体赖株的吞噬作用。采用吞噬阻断作用和流式细胞术确认问号钩体赖株诱导吞噬被抑制的巨噬细胞发生凋亡的情况。分别采用Triton X-114法和酚-水法提取问号钩体赖株外膜蛋白(leptospiral outer membrane proteins，Lep-OMP)和脂多糖(leptospiral lipopolysaccharide，Lep-LPS)。采用共沉淀技术从Lep-OMP提取物中捕获可与宿主细胞Fas结合的外膜蛋白成分并通过NanoLC-MS/MS技术鉴定。采用表面等离子共振分析技术(surfaceplasmon resonance，SPR)和等温滴定量热法（isothermal titration calorimetry，ITC）检测所捕获Lep-OMP组分（Lep-OMP047）的Fas结合能力。采用流式细胞术检测Lep-OMP、Lep-LPS和重组表达Lep-OMP047(rLep-OMP047)诱导小鼠和人巨噬细胞凋亡的情况。此外，采用实时荧光定量PCR、Western Blot、荧光分光光度法、流式细胞术和共聚焦显微技术检测rLep-OMP047诱导细胞caspase-8/-3的活化水平、Lep-LPS诱导下巨噬细胞TLR2介导的JNK/p38MAPK活化水平和转录因子c-Jun/ATF2/CHOP核转位情况以及Fas/FasL表达及膜转位水平。 结果:我们发现问号钩体赖株可引起吞噬作用被抑制的巨噬细胞发生凋亡，暗示钩体表面可能存在某些分子充当FasL样的作用并通过Fas/FasL-caspase-8/-3信号通路诱导巨噬细胞凋亡。小鼠或人Fas和Lep-OMP参与的共沉淀试验及后续质谱鉴定结果表明，问号钩体赖株LB047基因产物(Lep-OMP047)是唯一且同一个由小鼠或人Fas捕获到的钩体外膜脂蛋白成分。SPR和ITC试验结果证实，rLep-OMP047与Fas间相互作用的平衡解离常数（KD值）在5.20×10-6～2.84×10-9M范围内，表现为非常强的蛋白质-蛋白质间结合力。此外，5μg rLep-OMP047或1μg Lep-LPS能诱导小鼠和人巨噬细胞分别产生56.61％和21.90％或39.55％和15.80％的早期细胞凋亡率。然而，凋亡作用可分别被Fas-IgG和caspase-8/-3抑制剂阻断。此外，Lep-OMP047表达水平在问号钩体赖株感染宿主细胞期间显著升高;Lep-LPS激活JNK-c-Jun/ATF2和p38MAPK-ATF2会引起Fas/FasL表达水平升高和膜转位程度增加，而这两种MAPK的活化均由巨噬细胞TLR2介导。 结论:问号钩体赖株的FasL样膜表面脂蛋白和其LPS协同诱导了小鼠和人巨噬细胞通过Fas/FasL-caspase-8/-3信号通路的凋亡过程，这将促成问号钩体在宿主内的生存及钩体病的发生。