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骨性关节炎是中老年人的常见疾患，主要病理特征是关节软骨的退变。关节软骨退变的原因尽管是多方面的，但软骨细胞的结构破坏和功能丧失在其中起着至关重要的作用。采取有效方法保护软骨细胞的结构、调节软骨细胞的功能是防止软骨退变的关键措施，是治疗骨性关节炎的正确途径。陈基长教授研制的中药骨炎定（GUYANDING，GYD）能减轻骨性关节炎的临床症状，改善关节功能。为了深入探讨其作用机理，本实验采用软骨细胞培养技术观察其对软骨细胞代谢的影响。实验一：关节软骨细胞的分离和培养 采用胶原酶Ⅱ分段酶消化法从三月龄大耳白兔的关节软骨中分离出软骨细胞并进行原代和传代培养。每日在倒置显微镜下观察细胞形态及其生长情况，并用甲苯胺蓝异染色法进行细胞表型鉴定。结果表明，软骨细胞形成单层的时间原代培养1周左右，传代培养约4-5天，细胞以圆形或上皮样细胞形态为主。甲苯胺蓝染色证实，细胞可合成蛋白多糖，异染反应主要集中在细胞集落样生长区，异染程度以原代培养最为显著。实验二：骨炎定对培养兔软骨细胞增殖和蛋白质合成的影响 把传一代的软骨细胞接种于96孔培养板和24孔培养板中，培养24小时后细胞贴壁进行分组试验。1 MTT法测细胞增殖把96孔培养板中的32孔随机分为8组，每组4孔，每孔培养体积0.1ml。A组（对照组）加用5％血清培养液；B-G组：分别加用含有5％血清与1.25％、2.5％、5％、10％、20％、40％DMEM培养液；AO组为空白调零组，未接种细胞，只加有含有5％血清的DMEM 广州中医药大学九八级骨科博士：杨运东 导师；陈基长培养液。在培养48小时后用MIT ie检测细胞活性和增殖。结果GYD组 5O、10o、20％骨炎定可促进软骨细胞增殖，与对照组相比，差别有非常显著意义。2考马斯亮蓝祛检测细胞总蛋白 24孔培养板随机分为六组，每组4孔，分别为：A组：空白对照组。只加含有5％血清培养液；BS组分别加含有20％、10％、5％骨炎定、5％防风、5％当归注射液的培养液，培养三天后用考马斯亮蓝法检测细胞总蛋白。结果表明：5％、10％、20％可促进软骨细胞总蛋白合成，与对照组相比差别有非常显著性意义。炉仍刀l）实验三：骨炎定对培养软骨细胞NOS和SOD的影响 把原代培养的软骨细胞接种于24孔培养板中，细胞贴壁生长后随机分为6组并更换相应的培养液。A组（空白对照组人更换DMEM培养液；B组（实验对照组）更换含有 100U／rnllN’－－的培养液滑卜骨＊组：分别更换含有100、5o、2。50、1．25O骨炎定培养液（含有100UhaltwF）。焙养刀小时后，收集各孔．上清液，用比色法检测NOS、SOD ％性。结果表明，TN’－可使软骨细胞中的iNOS活性增加，5％骨炎定可显著提高软骨细胞SOD ％性，抑制i：NOS活性。实验四。骨炎定对培养软骨细胞超微结构的影响 传代培养的软骨细胞接种于8个培养瓶中，每瓶中预先置有盖玻片一块。培养24小时细胞贴壁后培养瓶随机分为两组，对照组：更换含有生理盐水的培养液。骨炎定组：更换含有5％骨炎定培养液。培养5天后，取出小盛片，2，5％戊二醛固定后行扫描电镜观察。收集培养瓶中的细胞，2．5％戊H醛固定后行透射电镜观察。结果：5％骨炎定组软骨细胞表面的 3 骨炎定对体外培养软骨细胞的影响纤细突起和皱稻较对照组多，细胞表面的囊泡数少，透射电镜观察软骨细胞胞浆丰富，线粒体和粗面内质网发达。超微结构的变化说明中药骨炎定对软骨细胞有保护作用。结论：本实验充分说明中药骨炎定可促进软骨细胞的增殖和蛋白质合成，保护软骨细胞兔受肿瘤坏死因子等细胞因子的损害，可提高自由基清除水平，调节软骨细胞的合成代谢，从而有效地保护软骨细胞，达到防止软骨退变的日的。