研究背景臭氧层的破坏已经成为重要环境问题之一。经过研究表明,这可能和人类过度使用氟氯烃(CFCS)类物质、气候改变等因素有关。伴随着臭氧层被破坏,抵达地表的太阳紫外线会逐渐增强,其中中波紫外线UVB(ultraviolet radiationB,UVB)增加尤为突出。日益增强的紫外线辐射不仅会伤害人的皮肤、眼睛,破坏人的免疫系统,还会对地球上的其他生物及粮食作物等造成危害。因此,UVB对生物体的损伤作用也越来越引起相关科研工作者的关注。不仅如此,近年来随着现代科技的发展,UVB在工业和医疗领域的使用也呈现增加的趋势,导致UVB职业暴露的人群也逐年增加。工业上主要包括从事工业弧焊、碳弧灯、水银灯制版或摄影以及飞行员等的职业人员：医疗上主要是一些紫外治疗仪的普及导致相关科室医生的职业暴露水平的上升。因此,研究紫外线对人造成损伤的机制,也能够为预防和治疗UVB职业暴露损伤提供重要的理论依据。人的表皮是最容易和直接受到UVB辐射的部位。适量的UVB照射,能促进体内矿物质代谢和维生素D的形成,但长期或过量UVB照射,则会引起皮肤红斑、炎症、皮肤老化,严重者甚至可引起皮肤癌。那么UVB是通过何种方式诱导辐射损伤的呢?有研究发现14-3-3σ(SFN或Stratifin)蛋白是表皮细胞DNA损伤的标记物,是高度保守的可溶性酸性蛋白14-3-3家族成员之一,它主要存在于上皮细胞,可与细胞内多种信号蛋白相互作用,发挥促进DNA损伤后诱导细胞G2/M期阻滞、调控细胞的生长、分化和增殖等生物学功能；此外,有研究表明,在一些肿瘤的发生发展中存在14-3-3σ表达的异常,如乳腺癌、肺癌中的14-3-3σ表达下调,然而在皮肤鳞癌中的表达未见相关研究。为了探索14-3-3σ在UVB辐射导致的人表皮细胞损伤中是否也发挥相应的生物学功能,并探讨其可能的上、下游信号分子；UVB诱导的皮肤鳞癌细胞和组织中是否也有14-3-3σ的表达异常?本研究以人表皮细胞(HaCaT)作为研究对象,并使用前期构建的稳定干扰14-3-3σ细胞株HaCaTKD 14-3-3σ(简称HaCaTKD),以波长为310nm、剂量为30mJ/cm2的UVB作为干预因子(30mJ/cm2的剂量为本实验室前期探索的研究低剂量UVB辐射损伤的最佳剂量),探索在UVB诱导的DNA损伤中,14-3-3σ对细胞增殖和周期的影响；可能与14-3-3σ相互作用的信号分子及其作用机制,以及14-3-3σ在皮肤鳞癌中的表达等,以期深入研究UVB导致HaCaT细胞辐射损伤机制。研究目的探讨14-3-3σ在30mJ/cm2的UVB诱导的HaCaT细胞增殖和周期变化中的作用机制,并进一步探索14-3-3σ的下游信号分子,以及14-3-3σ在皮肤鳞癌中的表达情况。研究方法1.细胞来源与培养人表皮细胞HaCaT购自中国武汉典型培养物保藏中心(CCTCC),人皮肤鳞癌A431细胞系购自中国实验细胞资源库中科院上海细胞库。稳定干扰14-3-3σ细胞株HaCaTKD 14-3-3σ由本实验室前期构建(详见参考文献)。A431细胞与HaCaT细胞均培养在含体积分数为10%的新生牛血清中、1×105U/L的青霉素、质量浓度100mg/L链霉素的DMEM高糖培养基中,于37℃、体积分数为5%的CO2培养箱中常规培养。另外,HaCaTKD细胞额外加入终浓度为100gg/ml的Geneticin (G418)。2.细胞分组、UVB照射待对数生长期的HaCaT细胞铺满培养皿80%～90%面积时,用PBS洗细胞2次,每个时间点设置3个皿。根据实验需要,将皿随机分为对照组和UVB组,然后均加入一定量的PBS(其中10cm培养皿加5mL PBS,6cm皿1.9mL PBS,96孔板加28μLPBS),对照组进行假照(即除不照射UVB外,其余处理过程均与处理组一致),UVB组置于距离光源垂直距离40 cm的紫外光源箱体指定位置,接受UVB照射3 min,累计照射剂量为30mJ/cm2;紫外辐射后均更换新鲜DMEM高糖培养基,分别继续培养至照射后3、6、12、18、24和30h时间点,收集HaCaT细胞总蛋白和RNA,其中UVB处理那一刻收集的细胞作为对照组(0h)。3.结晶紫染色HaCaT细胞和HaCaTKD细胞均按每皿3×105个细胞接种于3.5 cm的培养皿中,待HaCaT细胞长至70%-80%融合度时,两种细胞分别接受0、10、20、30、40、50、60和80 mJ/cm2的UVB照射,48 h后进行结晶紫染色,×200显微镜下随机拍摄5个视野,计算平均细胞数,以未照组(0 mJ/cm2)为参照。实验重复3次。4.CCK-8法检测细胞增殖HaCaT细胞和HaCaTKD细胞按每孔8×103个细胞、每孔100μl的细胞悬液,接种于96孔板中,常规培养24 h后接受30 mJ/cm2UVB照射,分别在照后0、12、24、48和72 h时间点每孔加入10μl的CCK-8溶液,继续常规培养2 h,测450 nm的吸光度OD值。实验重复3次。5.PI单染检测细胞周期HaCaT细胞和HaCaTKD细胞按1×106个细胞分别接种在6 cm培养皿中,待HaCaT细胞长至70%～-80%融合度时,两组细胞分别接受30 mJ/cm2的UVB照射,在照后0、6、12、18和24 h收集细胞,PI单染检测细胞周期按试剂盒说明检测。实验重复3次。6.蛋白质印迹法(western blot)HaCaT细胞和HaCaT细胞按同种密度接种,待HaCaT和HaCaTKD分别长至70%-80%融合度时,分别接受30mJ/cm2的UVB照射。在照射后0、6、12、18和24 h收集细胞,提取细胞总蛋白。每孔加入20μg蛋白,5%的浓缩胶和10%的分离胶进行电泳,并转移到聚偏二氟乙烯(Polyvinylidene, PVDF)膜上,5%的脱脂奶粉室温封闭1h,一抗4℃孵育过夜,TBST漂洗后二抗室温孵育1h,ECL发光试剂盒检测发光强度。实验重复3次。7. q-PCR法：提取总的RNA,测量其浓度和纯度,将RNA逆转录为cDNA,先通过PCR对引物进行测试。然后PCR扩增cDNA,以cDNA为原料,进行荧光定量PCR。将配置好的反应体系分别加到q-PCR板中,测出CT值,根据公式计算出mRNA相对含量。8.免疫组化石蜡切片脱蜡和水化。3%H202室温孵育5-10分钟；5-10%正常山羊血清封闭,室温孵育10分钟；滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液,37℃孵育1-2小时或4℃过夜；滴加适当比例稀释二抗(1%BSA-PBS稀释)；滴加适当比例稀释的SABC;显色剂显色(DAB或AEC)。自来水充分冲洗,复染,脱水透明(如需要)、封片,镜检。9.统计学处理结果以x±S表示。采用SPSS 20.0软件分析。多个实验组与对照组均数的比较采用方差分析的Dunnett-t检验,两因素多时间点资料采用析因方差分析,两样本均数的比较采用独立样本t检验,P<0.05为差异有统计学意义。研究结果1.UVB诱导14-3-3σ的mRNA和蛋白水平的表达升高30mJ/cm2的UVB照射后0、6、12、18、24h,14-3-3σ的lmRNA和蛋白水平的表达,与0h组相比均升高,随着时间的变化逐渐升高。2.14-3-3σ对HaCaT细胞增殖的影响不同剂量的UVB照射后48 h,UVB+HaCaT与UVB+HaCaTKD细胞密度呈剂量依赖性下降。未照射的HaCaT细胞与HaCaTKD细胞相比,差异有统计学意义(P<0.05)。与未照射组相比,HaCaT细胞在20 mJ/cm2照射后可出现显著抑制(P<0.05)；HaCaTKD细胞中在10 mJ/cm2照射后即可出现显著抑制(P<0.05)。经析因方差分析,无UVB照射情况下：HaCaTKD细胞的增殖能力显著低于HaCaT细胞(P<0.05)。同一时间点对两组进行组间比较,除了48和72 h时间点HaCaT组值大于HaCaTKD组(P<0.05),其他时间点差异无统计学意义(P>0.05)。固定分组进行不同时间点比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。30mJ/cm2 UVB照射情况下：UVB+HaCaTKD细胞的增殖能力低于UVB+HaCaT细胞(P<0.05)。同一时间点对两组进行组间比较,除0 h时间点外,其他时间点差异均有统计学意义(P<0.05)。3.14-3-3σ对HaCaT细胞周期变化的影响HaCaT细胞中处于G2/M期的细胞在6 h开始升高,12 h出现一个峰值,18h显著下降,且这3个时间点和0 h相比,差异均具有统计学意义(P<0.05)24 h回到0h的水平,差异无统计学意义(P>0.05)。而HaCaTKD细胞组,各观察时间点与0h组相比,差异均无统计学意义(P>0.05)。HaCaT细胞组在UVB照射后6-18 h发生G2/M期细胞比例上升,照射后6、12和18h的G2/M期含量与照射组0h相比,差异均有统计学意义(P<0.05)：在HaCaTKD细胞中,照后6h时G2/M期短暂升高,然后逐渐下降,未见明显G2/M期阻滞作用(P>0.05)。4.UVB照射后,14-3-3σ及下游周期相关蛋白的表达正常的HaCaT中,与照射前相比,照射后6,12,18,24h,14-3-3σ表达量显著升高(P<0.05),Cdc2下调(P<0.05),24h未见回升;Cdc25c、 CyclinB1下调(P<0.05),Cdc25c在24 h略有回升,CyclinB1在18、24 h略有回升。在HaCaTKD细胞中,照后24h与照射前比,14-3-3σ表达量升高较明显(P<0.05)：照后12,18,24h,Cdc25c、CyclinB1下调(P<0.05),Cdc2表达量在各时间点无显著改变(P>0.05)。5.UVB照射后,14-3-3σ与TPD52L1的协同作用测序分析发现：UVB照射后,14-3-3σ的转录水平先逐渐上升,然后下降,而TPD52L1的转录水平则是先下降后上升,他们呈相反的趋势。进一步通过q-PCR法验证14-3-3σ和TPD52L1的mRNA的表达水平,发现14-3-3σ和TPD52L1的mRNA的表达趋势与测序结果一致。14-3-3σ的表达水平逐渐上升,至18h达到最大值后开始下降,而TPD52L1的表达水平也逐渐上升至24h达到峰值后逐渐下降。14-3-36与TPD52L1的蛋白水平的变化趋势却是基本一致。6.14-3-3σ在皮肤鳞癌细胞和皮肤鳞癌组织样本中的表达情况14-3-3σ在皮肤鳞癌细胞A431细胞株中的表达低于正常皮肤细胞HaCaT细胞株,14-3-3σ在皮肤鳞癌组织中表达低于癌旁正常组织研究结论1、UVB照射可以导致HaCaT细胞生长抑制、发生周期阻滞、并诱导细胞发生凋亡,且呈剂量依赖,其机制可能是通过14-3-3σ调控周期相关蛋白Cdc2、Cdc25c, CyclinB1,协同TPD52L1引起的2、14-3-3σ在鳞癌细胞A431或鳞癌组织中的表达低于正常HaCaT细胞