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胶质细胞源性神经营养因子(glial cellline-derived neurotrophic factor GDNF)是1993年被发现的对多巴胺能神经元有特异性营养作用的一种神经营养因子，结构显示它是TGF-β超家族中的一个新的成员。自GDNF被发现以后，众多学者对其结构、分布、功能与作用进行了大量的研究，并取得了相当有意义的成果，同时GDNF在治疗神经系统疾病方面被广泛研究，包括对帕金森氏病(PD)、脊髓侧索硬化症(ALS)及其他神经变性疾病等领域的研究，其中PD的病理基础已经明确，是由于选择性多巴胺能神经元丧失导致多巴胺缺乏所致，目前认为，基因治疗可能是实现治疗PD这一目标的最佳途径，而对PD等疾病的治疗手段包括药物治疗和各种外科手术、脑组织移植等均只限于暂时的症状改善，不能从根本上延缓或阻止其病程进展，理想的治疗方法除了要纠正其脑内DA含量的不足，还要保护残存的DA能神经元。迄今为止，国内外的基因治疗研究探索主要集中于两个方向，一是通过给予各种神经营养因子或抗凋亡分子基因，研究其对DA能神经元的保护作用；二是通过给予酪氨酸羟化酶(TH)基因，提高DA的合成。国内外研究表明了GDNF是最强有力的保护因子，GDNF基因的有效表达可以减缓、阻止甚至逆转DA能神经元的退行性病变过程，为此我们克隆了大鼠GDNF全长基因，主要采用分子克隆、细胞培养和动物肌肉表达等研究方法，将GDNF基因分别构建入原核表达载体pET32a和真核表达载体pEGFP-Cl，通过IPTG诱导法和离体细胞转染法研究证实其具有明确的转基因生物活性后，再将真核重组表达质粒pEGFP-GDNF注射到小鼠后肢股四头肌内，初步了解其体内表达情况，以此寻找基因治疗的最佳途径。
主要研究方法和结果如下：
1．从2日内大乳鼠脑组织中提取总RNA，参照分子克隆指南稍作修改，合成cDNA第1、2链，加入引物通过PCR扩增目的基因，得到636bp的目的片段后，克隆到pMD18-T载体中，得到重组pMD18-T-GDNF。
2．将GDNF克隆到pGEM-T载体中，得到重组pGEM-T-GDNF；将重组质粒pGEM-T-GDNF、pET32a原核表达载体及pEGFP-C1真核表达载体进行BamHI、XhoI双酶切，构建重组表达质粒，然后对重组表达质粒进行酶切鉴定、PCR鉴定并测序验证。
3．将鉴定正确的原核重组表达质粒转入BL21(DE3)中进行表达，并采用SDS-PAGE、Western-blot等方法对表达产物进行鉴定。
4．以阳离子聚合物法将真核重组表达质粒转染入中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中表达，通过RT-PCR、免疫细胞化学技术及荧光显微镜观察来确定转染效率。
5．将pEGFP-GDNF注射入BABL/c小鼠后肢肌肉内，通过荧光显微镜和免疫组织化学方法观察体内表达情况。
结果：①GDNF基因的克隆
从新生大鼠脑组织中成功提取总RNA反转录cDNA后，PCR扩增的GDNF目的基因为636bp，与克隆载体连接构建克隆重组质粒，经酶切鉴定得到一条与目的基因大小一致的条带和一条载体带，测序后发现，目的基因序列与Genebank上发表的GDNF基因序列完全一致。
②GDNF基因的原核表达
为了获得GDNF基因的表达产物，成功将克隆质粒亚克隆至原核表达载体pET32a中，重组原核表达质粒经IPTG诱导后在蛋白电泳图谱可以看到明显的目的蛋白条带，Western-blot的特异条带也验证了这一点。
③GDNF基因的真核表达
成功将克隆质粒亚克隆至pEGFP-C1真核表达载体中，将真核重组表达质粒转染CHO细胞后，经RT-PCR鉴定和荧光显微镜观察发现，细胞液经扩增得到目的条带，在荧光显微镜下经蓝光激发，可以观察到CHO细胞胞浆内呈现绿色荧光，将小鼠后肢肌肉的石蜡切片进行胰蛋白酶抗原修复后，在荧光显微镜下观察到散在的绿色荧光，免疫组化染色可以看到肌纤维细胞周围有黄色的斑点，以上结果提示EGFP基因及GDNF基因的进一步表达，说明目的基因片段已成功表达。
结论：①本研究利用分子生物学技术，成功的克隆了大鼠GDNF基因，测序结果证明与Gelaebank发表的序列完全一致。
②将克隆至pGE-T载体中的GDNF基因亚克隆至原核表达载体pET32a中，并在E.coliBL21(DE3)中进行表达。经SDS-PAGE和Western-blot分析，表明目的基因获得了表达。
③将重组质粒pGEM-TGDNF中的GDNF基因亚克隆至pEGFP-C1真核表达载体中，成均的构建出真核重组表达质粒pEGFP-GDNF，以阳离子聚合物介导法将真核重组表达质粒pEGFP-GDNF转染至CHO细胞中，通过RT-PCR检测法、荧光检测和免疫细胞化学检测法证实GDNF基因在哺乳动物细胞中获得了表达。再将真核重组表达质粒pEGFP-GDNF注入BALB/c小鼠后肢肌肉中，同时设pEGFP-C1对照组，通过荧光检测法和免疫组织化学检测法证实了GDNF基因在小鼠肌肉中获得了表达。原核和真核重组表达质粒的成功构建，为进一步获得重组活性的GDNF蛋白和神经系统疾病的基础和临床的基因治疗研究奠定了基础。