研究背景和目的:急性髓系细胞白血病（AML）是一种能发生在各个年龄段具有高异质性和高死亡率的造血干细胞恶性克隆性疾病,AML的发生发展和特定基因与染色体表达异常相关。EVI-1基因位于人类染色体3q26.2,编码的EVI-1蛋白为核转录因子蛋白。EVI-1蛋白作为人类血液系统肿瘤和部分实体瘤的重要调控因子也参与哺乳动物的胚胎发育过程。多项研究表明在大约8%AML患者体内存在EVI-1基因过表达,且EVI-1基因过表达已经作为AML预后不良因素并与患者无病生存期相关。目前EVI-1基因过表达对AML发生发展的分子机制研究尚不完善,对能够有效抑制EVI-1基因的药物研究鲜有报道。因此,本研究着眼于EVI-1基因与AML的发病关联,并探讨传统化疗药物三氧化二砷（arsenic trioxide,ATO）在EVI-1转基因斑马鱼体内和体外白血病细胞株中对EVI-1的作用机制及对下游信号通路的影响,为ATO临床治疗EVI-1阳性白血病或其他实体肿瘤提供理论基础。方法:将重组质粒Tol2-GFP-EVI-1显微注射进入斑马鱼胚胎构建Tg（Tol2-GFP-EVI-1）斑马鱼鱼系（TE斑马鱼）,利用显微镜观察TE斑马鱼胚胎发育情况并对生存情况进行统计。利用RT-q PCR对TE鱼系和野生型斑马鱼（WT斑马鱼）对照鱼系胚胎中的造血标记物进行检测,并对TE和WT斑马鱼成鱼外周血进行涂片进行Wright-Giemsa染色法观察。使用转录组测序（RNA-seq）对TE斑马鱼和WT斑马鱼进行测序和GO,KEGG分析并应用RT-q PCR和western blot技术对测序结果进行验证。当TE斑马鱼发育至16hpf时加入50μM ATO处理至3dpf,采用RNA-seq对TE斑马鱼和TE加药斑马鱼进行测序和分析并利用分子生物学技术对测序结果进行验证。使用RT-q PCR和western blot技术对初诊急性髓细胞白血病病人及5种白血病细胞株进行EVI-1表达水平的检测并筛选出THP-1和K562细胞进行后续实验。将靶向EVI-1基因小干扰RNA（si RNA-EVI-1）和阴性对照干扰片段（si RNA-control）成功转染THP-1和K562细胞并敲减EVI-1基因的表达,利用CCK8、细胞周期流式技术检测肿瘤细胞增殖水平的改变;细胞涂片HE染色,细胞凋亡流式技术检测肿瘤细胞凋亡水平的变化。采用western blot技术检测EVI-1敲减之后对NRAS,ERK通路（total ERK,P-ERK,p27 kip1）的影响,并通过ERK通路抑制剂U0126的作用证明EVI-1通过调控NRAS/ERK途径影响肿瘤细胞增殖水平。此外,使用targetscan数据库对能够结合NRAS基因的mi RNA进行预测,选取let-7、mi R196、mi R326、mi R505、mi R124、mi R361为目的mi RNA,利用RT-q PCR技术检测EVI-1与预测目的mi RNA的关系,筛选出mi R124的表达水平与EVI-1基因呈负相关。利用双荧光素酶报告实验检测mi R124能直接结合NRAS基因3‘UTR并抑制其表达;通过流式技术检测细胞周期和CCK8方法,发现抑癌基因mi R124通过抑制NRAS,ERK通路的表达来调控肿瘤细胞的增殖水平。利用western blot技术检测EVI-1敲减后对JNK通路及下游凋亡相关因子（total JNK,P-JNK,PUMA,P-p53,PUMA,Bcl-2,Bcl-xl,Bax,caspase 3,caspase 9）的影响。THP-1,K562白血病细胞株分别加入0,1,3μM浓度ATO后,利用RT-q PCR、western blot、,CCK8、细胞涂片HE染色和流式细胞方法分别检测ATO在体外白血病细胞株中对EVI-1基因的抑制作用,对下游ERK和JNK通路的调控以及对肿瘤细胞增殖水平和凋亡水平的影响。结果:本实验成功构建Tg（Tol2-GFP-EVI-1）转基因斑马鱼鱼系,并发现TE斑马鱼的生存率明显较低并存在不同程度的胚胎多器官发育异常,有小眼、弯曲体、心包水肿和无尾等表型。TE斑马鱼存在胚胎造血缺陷,EVI-1基因过表达在斑马鱼早期造血过程中髓系和红系造血标记物GATA-1、runx-1、mpo、lmo2、pu.1、scl、GATA-2和c-myb基因的表达失调及成鱼外周血循环中出现造血干细胞的累积等类似人类AML的关键表型。TE斑马鱼与WT对照相比有788个表达差异基因,存在与胚胎造血,胚胎发育相关的多种重要信号通路表达异常,其中MAPK通路的异常激活是是最具特征的改变。ATO能够抑制TE斑马鱼体内EVI-1基因的表达水平,并能在一定程度上逆转由于EVI-1基因过表达造成的斑马鱼体内MAPK通路激活。在白血病原代细胞及白血病细胞株中EVI-1基因的表达增加,其中THP-1和K562细胞中的EVI-1表达水平最高。敲减THP-1和K562细胞中的EVI-1基因,肿瘤细胞的增殖水平明显受抑,凋亡水平明显增强。EVI-1基因在体外白血病细胞中能够抑制抑癌基因mi R124的表达,间接促进NRAS表达并导致ERK通路异常激活,促进细胞G1/S期转换从而增强肿瘤细胞的增殖水平;EVI-1基因在体外白血病细胞中能够通过抑制JNK通路和其下游凋亡相关调控因子从而抑制肿瘤细胞的凋亡水平。ATO能够抑制EVI-1基因在原代白血病细胞及THP-1,K562白血病细胞株中的表达水平,并通过抑制ERK通路及相关调控因子的表达抑制细胞G1/S期转换抑制肿瘤细胞的增殖水平;与此同时也能激活JNK通路及其下游凋亡相关蛋白表达促进肿瘤细胞凋亡。结论:在体内,EVI-1基因过表达能够降低TE转基因斑马鱼的生存率并造成TE斑马鱼胚胎多系统器官发育异常和造血紊乱,激活斑马鱼体内MAPK通路;ATO能够抑制TE斑马鱼体内EVI-1基因的表达并且逆转MAPK通路的异常激活。在体外,EVI-1基因在白血病细胞株中过表达能够抑制mi R124表达,间接促进NRAS/ERK途径进而提高肿瘤细胞的增殖水平;EVI-1基因能够抑制白血病细胞株中的JNK通路从而抑制肿瘤细胞凋亡。ATO在体外通过抑制EVI-1基因的表达进而间接抑制异常激活的ERK通路并促进JNK通路从而抑制肿瘤细胞增殖和诱导肿瘤细胞凋亡。