【摘 要】
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鹅星状病毒（Goose astrovirus,GAst V）作为一种新发病原,可导致雏鹅全身性内脏痛风,表现为高感染率和高死亡率。2016年暴发以来,给中国养鹅业带来了严重损失。刺突蛋白（Spike）位于鹅星状病毒表面,是重要的抗原蛋白,可诱导宿主的免疫反应,并介导病毒粒子与细胞表面受体的结合,因此Spike蛋白是诊断试剂开发和药物筛选的重要靶标。1.鹅星状病毒Spike蛋白的表达与纯化首先将构建
【基金项目】
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河南省农业科学院自主创新项目（2022ZC67）
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鹅星状病毒（Goose astrovirus,GAst V）作为一种新发病原,可导致雏鹅全身性内脏痛风,表现为高感染率和高死亡率。2016年暴发以来,给中国养鹅业带来了严重损失。刺突蛋白（Spike）位于鹅星状病毒表面,是重要的抗原蛋白,可诱导宿主的免疫反应,并介导病毒粒子与细胞表面受体的结合,因此Spike蛋白是诊断试剂开发和药物筛选的重要靶标。1.鹅星状病毒Spike蛋白的表达与纯化首先将构建好的p ET-28a-Spike质粒转化到E.coli BL21感受态细胞,经菌液PCR、测序后获得序列正确的阳性菌株。原核表达条件优化后,最终选择在16℃条件下加入终浓度为1 m M IPTG过夜诱导,SDS-PAGE结果显示可溶性Spike蛋白成功表达。使用镍离子亲和层析技术纯化获得了Spike蛋白,经SDS-PAGE、Western-blot鉴定,获得了高纯度（95%）、高浓度（1.5mg/m L）的Spike蛋白。2.鹅星状病毒Spike蛋白单克隆抗体的制备通过Spike蛋白免疫BALB/c小鼠,细胞融合,亚克隆,采用ELISA、IPMA共筛选到3株阳性单克隆细胞,分别为:1A5、2B4、12E6。经Western-blot、IFA鉴定,3株单克隆抗体均与Spike蛋白具有良好的反应,其中2B4、12E6与GAst V发生反应。亚型鉴定结果显示单抗12E6、2B4为Ig G2b亚类,单抗1A5为Ig G2a亚类;轻链均为κ链。敏感性结果显示,抗体效价在1:51 200以上。依据GAst V XX株Spike序列合成15个氨基酸的25个重叠肽（包含7个氨基酸的重叠量）,ELISA、Dot-blot结果显示单抗1A5识别的表位为（EP16）ELRNRLNIADGDYVI,单抗2B4识别的表位为（EP21）AGDSNPGETFQNFKM多肽,且均为线性B细胞表位。3.鹅星状病毒Spike蛋白亲和肽的虚拟筛选以火鸡星状病毒2型Spike蛋白的晶体结构为模板,利用SWISS-MODEL进行同源建模,获得GAst V Spike蛋白的三维结构。基于分子对接技术进行计算机虚拟筛选,运用SYBYL软件选定Spike蛋白的C端部分区域为活性口袋来建立多肽库,再利用Surflex-Dock/SYBYL将库中的多肽配基与选定口袋进行对接,最后通过一致性评分函数（Cscore）综合评估对接结果,筛选出30条特异识别GAst V Spike蛋白的多肽,为后续的抗病毒研究奠定了基础。4.鹅星状病毒抗病毒亲和肽的筛选与鉴定利用IPMA初步筛选到3条抑制GAst V增殖的多肽,结合多肽的细胞毒性结果,最终筛选到多肽AP21。亲和性鉴定结果显示多肽AP21可以与Spike蛋白特异性结合,Western-blot、IFA、TCID50结果显示亲和肽AP21对GAst V具有显著的抗病毒活性,为GAst V抗病毒药物开发奠定了基础。抗病毒靶点分析结果显示,AP21作用的靶点位于Spike蛋白结构的侧面,具有特定的空间构象。
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