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NK细胞在肿瘤免疫监视中发挥了举足轻重的作用,基于NK细胞的肿瘤免疫治疗也日益得到人们的关注和青睐,因此NK细胞效应功能调控机制的研究变得尤为重要。NK细胞效应功能受多方面因素的调控,如活化性受体或抑制性受体、细胞因子、转录因子或细胞代谢等等。m6A修饰作为mRNA转录后最广泛的修饰方式,对细胞发育分化和效应功能具有广泛的作用。但是,基于m6A修饰的表观转录组学对NK细胞的调控研究却无人涉及。本研究中,我们揭示了m6A甲基转移酶Mettl3与NK细胞效应功能的关系,及其内在分子机制。1、Mettl3表达水平与NK细胞效应功能正相关首先通过流式细胞术分析,我们发现NK细胞中Mettl3表达几乎为全阳性,暗示Mettl3对NK细胞具有重要作用。为了研究Mettl3与NK细胞的关系,我们将NK细胞分为Mettl3high NK细胞和Mettl3low NK细胞。结果发现Mettl3high NK细胞呈现更强的效应功能表型,表达更高水平的活化性受体、凋亡诱导分子、转录因子、溶细胞颗粒和细胞因子等等。随后,我们构建黑色素瘤肺转移模型、结肠癌肝转移模型和慢性肝癌模型。结果显示在肿瘤微环境中,NK细胞上Mettl3表达水平显著下调,同时Mettl3与NK细胞数量、活化性受体、转录因子或效应分子的表达呈正相关性。通过基因芯片分析,我们发现肝癌病人的肿瘤浸润NK细胞比正常NK细胞相对低表达METTL3基因,并且NK细胞效应功能相关基因的表达也有所下降,而NK细胞耗竭相关基因的表达水平则明显增加。更重要的是,METTL3基因表达水平越高,癌症病人预后越好。以上结果提示NK细胞效应功能可能依赖Mettl3。2、NK细胞抗肿瘤功能依赖Mettl3为了研究Mettl3对NK细胞效应功能的影响,我们构建了 NK细胞特异性缺陷 Mettl3鼠,即Mettl3fl/fl-Ncr1Cre/+小鼠（cKO）,同窝Mettl3fl/fl-Ncr1+/+小鼠（WT）作为对照。通过小动物成像和HE染色,我们发现与WT鼠相比cKO鼠中肿瘤的发生发展和迁移明显严重且生存期显著缩短。不仅如此,清除NK细胞的WT鼠与未清除NK细胞的cKO鼠在荷瘤后,它们的生存期并没有显著差别,说明NK细胞抗肿瘤功能依赖Mettl3。3、Mettl3缺陷影响NK细胞稳态通过流式细胞术分析,我们发现cKO鼠多个脏器中的NK细胞比例和数量均显著低于WT鼠。虽然Mettl3缺陷不影响NK细胞成熟表型,但NK细胞多个活化性受体、凋亡诱导分子FasL和转录因子T-bet均显著下调。除了传统NK细胞,肝脏驻留NK细胞数量的维持和效应功能分子的表达也同样依赖Mettl3。上述结果提示了 Mettl3通过维持NK细胞数量及效应分子表达促进NK细胞抗肿瘤免疫的细胞机制。4、Mettl3促进肿瘤微环境中NK细胞浸润及效应功能为了探究Mettl3缺陷导致NK细胞数量的下降和活化性受体表达水平的降低是否会影响NK细胞在肿瘤微环境中的应答,我们构建结肠癌肝转移模型。结果显示WT鼠NK细胞的比例和绝对数均显著增加。然而cKO鼠中肿瘤浸润NK细胞比例或数量却有所下降。除了肝脏转移肿瘤,在肺脏转移肿瘤中我们也看到了类似的现象。更为重要的是,Mettl3缺陷导致肿瘤浸润NK细胞表达效应分子CD107a、Granzyme B或IFN-γ的水平显著下降。因此,我们的结果进一步证明Mettl3对NK细胞抗肿瘤免疫至关重要。5、Mettl3缺陷削弱NK细胞对IL-15的应答在肿瘤微环境中,细胞因子Il15基因的相对表达量明显增加,这提示我们Mettl3缺陷可能影响NK细胞对IL-15的响应。经过体内或体外高浓度IL-15刺激后,与WT鼠相比,cKO鼠NK细胞扩增能力明显减弱,细胞比例和数量仅轻微增加。IL-15刺激后Mettl3缺陷明显抑制NK细胞分泌GranzymeB或IFN-γ等效应分子的能力,这与肿瘤微环境中观察到的现象一致。提示Mettl3可能通过影响IL-15信号通路从而调控NK细胞功能。6、Mettl3缺陷NK细胞中IL-15R下游信号受损Mettl3缺陷并不影响NK细胞表面IL-15受体的表达水平。进一步分析发现,NK细胞内JAK1和JAK3的活化没有显著改变,而STAT5的磷酸化水平仅略有下降。令人惊讶的是,Mettl3缺陷导致AKT磷酸化水平显著降低,同时AKT下游信号分子mTOR的磷酸化也受到抑制,并导致NK细胞氧化磷酸化的能力被削弱。以上结果说明Mettl3通过调控IL-15R下游信号通路,从而促进NK细胞效应功能。7、Mettl3通过SHP-2维持IL-15R信号通路经过Mettl3-RIP-seq、MeRIP-seq和蛋白质组学联合分析,我们发现IL-15R下游基因Ptpn11既能够被m6A修饰,也能被Mettl3蛋白结合,同时其蛋白产物SHP-2的表达水平在Mettl3缺陷后显著降低。SHP099抑制SHP-2后,NK细胞上AKT和MAPK磷酸化水平明显降低,而STAT5磷酸化水平几乎不变。同时,NK细胞增殖水平下降及比例降低。并且SHP099处理显著抑制NK细胞表达效应分子。以上结果说明Mettl3能够促进SHP-2表达,以此维持NK细胞IL-15R下游信号通路。8、Mettl3缺陷导致NK细胞中Sox4水平增加通过mRNA-seq和MeRIP-seq分析,我们发现转录因子Sox4基因能够被m6A修饰,Mettl3缺陷后小鼠NK细胞中Sox4蛋白或基因表达水平均显著增加。同时NK92细胞敲除MET-TL3基因后,SOX4基因表达量也有所提高。以上结果证明m6A修饰直接抑制NK细胞中转录因子Sox4的表达。9、SOX4与NK细胞功能负相关,且是不良预后的指标无论是mRNA相对表达量还是蛋白含量,在多种癌症病人肿瘤组织中,SOX4表达水平均显著高于正常组织。相关性分析显示SOX4基因表达水平与NK细胞效应功能负相关,与NK细胞耗竭正相关。更重要的是病人肿瘤组织中SOX4基因表达越高,癌症病人的预后越差。以上结果暗示SOX4可能负调NK细胞功能。综上所述,一方面,我们首次揭示Mettl3对NK细胞稳态维持和活化受体表达必不可少,并且NK细胞介导的抗肿瘤免疫依赖Mettl3。进一步研究证实Mettl3通过促进SHP-2蛋白表达,维持IL-15R信号通路,以促进NK细胞效应功能。另一方面,我们发现转录因子SOX4与NK细胞功能负相关且是不良预后的指标,而Mettl3能够抑制SOX4基因和蛋白表达水平,暗示Mettl3还可以通过负调SOX4来促进NK细胞效应功能。