【摘 要】
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目的: 构建特异性BCR/ABL的siRNA真核细胞表达载体并转染人类红白血病细胞株K562,了解重组载体对K562细胞BCR/ABL融合基因的干扰效果以及对其生长增殖影响,为进一步探索BC
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目的: 构建特异性BCR/ABL的siRNA真核细胞表达载体并转染人类红白血病细胞株K562,了解重组载体对K562细胞BCR/ABL融合基因的干扰效果以及对其生长增殖影响,为进一步探索BCR/ABL基因功能,RNA干扰(RNAi)分子靶向基因治疗慢性髓细胞性白血病(CML)提供一种新的手段和理论基础。 方法: 1.根据GenBank数据库提供的BCP/ABL基因核苷酸序列,按照Tuschl设计原则,选择设计双链小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),再转化为能表达其小发卡结构RNA(Small hairpin RNAs,sh RNA)的DNA序列,并与pTER质粒定向连接,构建受控于人RNA聚合酶Ⅲ启动子H1的真核表达载体pTER117、pTER363,经限制性内切酶酶切和DNA测序进行鉴定。 2.通过脂质体Lipofectamine 2000瞬时转染K562细胞24小时,RT-PCR和细胞化学染色检测BCR/ABL mRNA和P210蛋白。在瞬时转染的基础上,利用该载体带有的药物抗性筛选系统进行稳定转染,由于该载体带有受四环素(tet)调控的开关基因,才使筛选出依赖P210蛋白生长的重组载体和空载体的阳性K562细胞克隆成为可能,采用
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