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胶原酶是特异性作用于胶原蛋白、明胶的一类蛋白水解酶,它能够水解胶原蛋白的三维螺旋结构而不破坏其他蛋白与组织。微生物胶原酶来源主要是梭菌属、芽孢杆菌属和弧菌属菌株。商品化的胶原酶就是从溶组织梭状芽孢杆菌提取制备的。梭菌胶原酶Col G、Col H和产气荚膜菌胶原酶Col A的结构性质已得到充分表征,这三种胶原酶常作为研究酶学性质的模式酶。随着研究的深入,越来越多的产胶原酶菌株被分离筛选出来,不同来源的胶原酶结构与性质差异性大,表明胶原酶的结构和功能具有多样性。蜡状芽孢杆菌具有丰富的产酶系统,是产胶原酶优良菌株。本文围绕胶原酶进行研究,鉴定了一株产胶原酶菌株Bacillus ceueus MH19,通过测序获得了全基因组序列,从基因组挖掘胶原酶基因Col B用于大肠杆菌重组表达,通过常规的微生物培养、提取分离也获得了天然的胶原酶,并分别进行了酶活测定与评估,主要研究结果如下:（1）对分离自屠宰厂的产胶原酶菌株进行鉴定,用于后续全基因组测序及胶原酶基因筛选。通过据菌株培养观察、镜检、MYP培养和部分生理生化试验,结合16S r DNA序列比对分析,筛选鉴定出蜡样芽孢杆菌Bacillus ceueus MH19。（2）采用二代结合三代测序技术对Bacillus cereus MH19进行全基因组测序,基因组大小为5,534,899bp,GC含量为35.28%,由一条5,247,580bp的环状染色体和一条287,319 bp的环状质粒组成。预测染色体基因有5,335个,质粒基因253个,绘制了染色体圈图和质粒圈图。对基因组进行功能注释,GO功能注释主要有代谢过程、细胞过程和单组织过程,参与基因分别有1615、1465、1259个。COG共注释3879个基因,占全基因组序列的69.41%。COG功能注释主要有10.19%的基本功能预测、9.07%的转录、8.78%的氨基酸转运和代谢、6.80%的翻译,核糖体结构和生物合成,其次是5.55%的细胞壁/膜/包膜生物合成、5.68%的信号转导机制、6.30%的碳水化合物转运与代谢、5.24%的辅酶转运与代谢和5.61%的无机离子的运输与代谢。KEGG共注释2920个基因,占全基因组序列的52.25%。共线性、共有和特有基因、基因家族的比较基因组分析发现Bacillus cereus MH19的特异性主要体现在环境适应性,即适应环境能力得到了强化,其基因组含有特异基因家族18个及数量最多的特有基因944个。进化选择压力分析表明Bacillus cereus MH19基因组有36个正向选择基因,存在多个转录调节因子。这些调节因子对抗药性的产生、毒力基因的合成、DNA的复制和修复、细胞存活有积极调控作用。（3）B.cereus MH19基因组胶原酶基因的挖掘。通过GO、COG、KEGG、NR、SWISSPROT、IPR多重注释、比对,发现Bacillus cereus MH19基因组有5种不同的胶原酶基因,分子量分布范围35.7-110 k D。序列比对和系统发育树分析表明BCC000504、BCC003388胶原酶基因序列与典型胶原酶基因Col G、Col A、Col H更为接近,BCC003615次之。结构域与功能分析表明,胶原酶BCC000504、BCC003388与胶原酶Col G、Col A、Col H性质较为相似,BCC004271与BCC004272类似,BCC003615可能与其余胶原酶性质有较大差异。对胶原酶的结构进行分析并以溶组织梭菌胶原酶G晶体结构为模板对BCC000504三维结构进行建模,建立的BCC000504胶原酶三级结构模型是可接受的蛋白模型。三级结构模型的建立有助于从分子水平上了解胶原酶的作用机制。将BCC000504命名为Col B,用于大肠杆菌原核表达。（4）研究了Bacillus cereus MH19发酵液中天然胶原酶的分离纯化及酶学性质。采用分步纯化,经硫酸铵沉淀、离子交换柱层析及凝胶层析纯化得到胶原酶BCC,分子量为110 k D,酶活为257.20 U/mg,提纯倍数为6.07,得率为9%。BCC酶的最适温度为37℃,最适p H为7.5。Ca2+对酶活有促进作用,Mn2+、Fe2+、Zn2+、Pb2+、Cu2+对酶活有抑制作用。EDTA、EGTA可抑制胶原酶的酶活性,表明BCC为一种金属蛋白酶。BCC对I型胶原有特异性,属于I型胶原酶。（5）研究了胶原酶Col B在大肠杆菌中的原核表达。从Bacillus cereus MH19基因组挖掘得到Col B基因序列,优化、改造后构建表达质粒p ET30a-Col B,转化至大肠杆菌BL21中诱导表达,Ni-IDA亲和层析柱纯化后获得了纯度较高的重组Col B,SDS-PAGE及Western Blot分析表明重组Col B分子量为110 k D。胶原酶谱法结果表明重组Col B具有胶原酶活性,能够水解Ⅰ型胶原,测得的胶原酶活性为200.76U/mg。重组胶原酶Col B与提取的天然胶原酶分子量均为110 k D,对I型胶原有特异性,两者可能为同一种酶。