肿瘤的发生发展与DNA的损伤是否能够正常地修复有着密切且复杂的关系。一方面,在肿瘤的发生发展过程中可能会带来一系列基因的突变,包括参与DNA损伤修复的基因。一些抑癌基因的突变,诸如p53,BRCA1基因的突变会造成更加严重的后果。另一方面,DNA损伤的正常修复是基因组保存稳定的基础。如果DNA的损伤未能得到及时和有效的修复,就可能会引起基因的突变,进而可能会产生遗传毒性损伤并引发肿瘤。对于人体来说,最严重的DNA损伤方式之一是DNA的双链断裂(Double-Strand Break,DSB)。而双链断裂的修复方法主要有两种,一种是非同源末端连接修复(Non-homologous end joining,NHEJ),容易存在差错的修复。另一种是能够确保遗传信息高保真传递的修复方式,即同源重组修复(Homologous Recombination,HR)。当DNA发生DSB,启动NHEJ模式时,由Ku70和Ku80组成的复合物Ku蛋白(Ku Heterodimer)首先结合双链断裂的末端,然后招募DNA依赖蛋白激酶催化亚基(DNA-PKcs)激活其激酶活性,然后DNA-PKcs自身发生磷酸化后启动NHEJ通路,随后招募末端剪切蛋白和DNA连接酶完成修复。在NHEJ修复过程中,Ku蛋白是率先识别断裂位点并结合在断裂处稳定断裂的双链,然后招募一系列下游的信号分子并为它们提供平台。大量的研究表明RCC2(Regulator of Chromosome Condensation 2)与肿瘤的发生发展密切相关,大多数的报道称RCC2在肿瘤细胞和组织中高表达,能够促进肿瘤细胞的增殖和转移并导致化疗的耐受。但有少数研究表明RCC2能够抑制肿瘤细胞的转移。因此,RCC2在肿瘤的发生发展中的作用还有待进一步厘清。而RCC2在DNA损伤修复的作用可能会为它在肿瘤的作用的研究提供有力的证据和基础。因此,本课题主要研究RCC2在DNA损伤修复中的生理作用。我们使用激光微辐照技术结合免疫荧光染色技术(Immunofluorescence,IF)发现RCC2能够直接参与到DNA的损伤修复中,并募集到DNA损伤的位点。随后的彗星实验发现缺失RCC2会造成更加严重的DNA损伤。通过内源性的免疫共沉淀实验(Co-Immunoprecipitation,CO-IP)发现RCC2与Ku蛋白存在内源性的相互作用。我们构建了RCC2的一系列突变体,通过免疫沉淀和免疫印迹实验发现RCC2与Ku蛋白结合的关键区域是RCC1 like domain(RLD)结构。此外,我们还构建了Ku70和Ku80的突变体,并发现Ku80通过DNA binding core结构与RCC2相互结合,并通过这个结构的后半段与Ku70结合。通过DNA损伤药物处理和敲低RCC2发现ATM和ATR的磷酸化水平比对照组高,CHK1和p21较对照组显著降低。据此,我们推测RCC2在DNA损伤修复过程中主要在ATRCHK1通路中发挥作用,并且可能会抑制G1/S的进展。同样,我们通过PI染色和流式分析发现,RCC2缺失后细胞周期显著加快。Ku蛋白的缺失也会造成同样的结果。另一方面,在DNA损伤药物处理的条件下,RCC2与Ku蛋白的相互作用显著增强。结合这两点,我们可以推测RCC2与Ku蛋白在DNA损伤修复中协同发挥作用。我们通过使用NHEJ和HR修复通路的细胞模型EJ和HJ发现,RCC2的缺失严重影响NHEJ的修复效率。而在Ku蛋白缺失的前提下,进一步敲低RCC2会对NHEJ通路发生更加严重的影响。因此RCC2在DNA损伤修复的过程中与Ku蛋白协同作用调控DNA双链断裂的NHEJ修复通路。总的来说,在DNA损伤修复的过程中,RCC2在ATR-CHK1通路中发挥作用,能够直接定位到损伤位点并与Ku蛋白协同作用共同调控NHEJ修复。