近年来,随着人类生活和现代印染工业的快速发展,人类接触到纺织品染料的几率逐渐上升,而染料生产废水及纺织品染料废水的环境污染问题也越来越受到了人们的关注。蒽醌染料具有色彩鲜艳、日晒牢度出众等优点,常用于合成纤维的染色。相关研究指出,蒽醌类化合物可能引发机体内活性氧的产生,诱发氧化应激反应从而产生DNA损伤。茜素红S(Alizarin Red S,ARS)是一种蒽醌类染料,属于茜草素衍生物的一种,主要用作纺织品染料、生物医药领域的钙离子显色剂、以及地质学领域的含钙矿物染色。茜素红S作为钙离子显色剂,可以通过比色法定量检测生物组织中钙离子的分布和积累,为研究骨骼生长、钙质积累提供了精确定量的研究方法。在地质学上,可以使用茜素红S染色岩石薄片,研究薄片样品中的含钙矿物情况。在分子层面上,目前已有的毒理学研究已经阐明了茜素红S与人血清白蛋白(HSA)、牛血清白蛋白(BSA)的作用现象与机理,也有研究报道了茜草素衍生物对乙酰胆碱酯酶、α-淀粉酶等酶的活性存在抑制现象。而在细胞层面上,与茜素红S相似物质,如茜草素、紫红素、醌茜等几种物质的细胞毒理已有相关研究进展,分别从对细胞存活率和活性氧含量影响等角度,评估了它们的抗氧化剂性质。茜素红S对机体氧化应激效应的研究目前尚不深入:在分子层面上,过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、溶菌酶等几种常见的抗氧化酶在茜素红S的暴露下的酶活性变化及其作用机理尚未有相关报道;在细胞层面上,茜素红S对于肝细胞氧化应激效应的影响尚不明确。因此,本文从分子和细胞两个层面出发,评估了茜素红S对多种抗氧化酶和肝细胞的毒性作用,并探讨了实验现象背后的机理。本文由以下四部分组成:第一部分:通过多种实验方法,在分子水平上探讨了茜素红S对过氧化氢酶的毒性作用。过氧化氢酶是一种重要的抗氧化酶,主要作用是分解细胞代谢过程中积累的过氧化氢。研究结果表明,茜素红S与过氧化氢酶主要通过静电作用力自发地结合,引起了过氧化氢酶结构与构象的轻微改变,对酶活性具有抑制作用。当茜素红S暴露浓度达到5×10-6mol·L-1后,过氧化氢酶的相对活性下降至了76.2%。酶活性受到抑制的可能机理是茜素红S与过氧化氢酶活性中心附近的His74氨基酸残基结合,从而影响了过氧化氢酶的活性。第二部分:通过多种实验方法,在分子水平上探讨了茜素红S对超氧化物歧化酶的毒性作用与机理。超氧化物歧化酶在分解细胞呼吸电子传递链产生的超氧根阴离子副产物的过程中起到了关键作用,能过够催化超氧根阴离子的歧化反应,从而将其分解为过氧化氢和氧气,保护细胞免受氧化应激损伤。研究结果表明,茜素红S能够轻微抑制超氧化物歧化酶的活性,超氧化物歧化酶在6×10-6 mol·L-1浓度的茜素红S暴露下,相对与未受暴露的情况酶活性被抑制到了 88.3%。茜素红S与超氧化物歧化酶相结合,降低了体系的散射粒径,但是对超氧化物歧化酶的蛋白质二级结构、蛋白质骨架结构、以及酪氨酸残基附近微环境没有产生明显的影响。研究结果表明茜素红S主要通过静电作用力结合在了超氧化物歧化酶亚基之间的空隙,减少了超氧化物歧化酶活性中心与底物的接触,从而间接影响了超氧化物歧化酶的酶活性。第三部分:通过多种实验方法,在分子水平上探究了茜素红S对溶菌酶的毒性作用与机理。溶菌酶与机体的先天免疫系统有关,能够水解细菌的细胞壁促使细菌裂解。此外,溶菌酶能够抑制氧化应激相关基因的表达,对机体内氧化应激物质具有抑制作用,是一种广泛存在于机体内的间接抗氧化蛋白。研究结果表明,茜素红S能够与溶菌酶相结合,增大了体系的散射粒径,但对溶菌酶的蛋白质骨架结构、及其中的芳香族氨基酸残基附近微环境并未产生明显的影响。茜素红S能够抑制溶菌酶的活性,当茜素红S浓度达到1×10-5 mol·L-1时,溶菌酶的活性降低至了未受暴露情况时的89.7%左右。可能的原因是ARS通过静电作用力与溶菌酶的关键氨基酸残基Glu35发生了作用,从而导致了溶菌酶的活性在ARS的暴露下受到了抑制。第四部分:通过体外的细胞实验,进一步探究了茜素红S对小鼠原代肝细胞的毒性作用。细胞活力的测定结果表明,在较高浓度的茜素红S染毒24 h后对肝细胞的活性具有明显的促进作用,该现象与文献中茜草素的相关研究结果一致。而细胞活性氧(ROS)的测定结果则表明,茜素红S诱发了肝细胞的氧化应激效应,细胞内活性氧含量在24 h内轻微上升。随着茜素红S浓度的增加至1×10-4 mol-L-1,细胞内活性氧的含量从7.4%提升至了 8.9%。细胞内酶活性的测定实验则表明,细胞内过氧化氢酶和超氧化物歧化酶两种直接抗氧化蛋白的酶活性在茜素红S的暴露下受到了显著的抑制。随着茜素红S浓度达到2×10-5 mol·L-1后,细胞内过氧化氢酶和超氧化物歧化酶活性分别降低到了未暴露情况下的48.3%和80.3%附近。可以推测组织内抗氧化酶的酶活性变化,是诱发细胞氧化应激反应的原因之一。本文的研究结果表明,茜素红S对多种抗氧化酶的酶活性具有明显的抑制作用,且对于生物体肝细胞发生作用后引起了肝细胞的氧化应激效应。