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目的： 缺血性神经元损伤是脑血管疾病中最经常发生的一种病理改变，常导致严重的后果。随着医疗技术的发展，对于缺血性脑血管疾病有了较好的治疗手段，使脑组织的血流得以及时恢复。但脑血流的重新恢复往往会引起神经元的再灌注损伤，影响缺血性脑血管疾病的治疗效果与预后。因此神经元的再灌注损伤一直是缺血性脑血管疾病的研究热点。通过研究发现神经元的再灌注损伤的形式是神经细胞的凋亡。主要是通过：1) 死亡受体途径2) 线粒体途径。对于线粒体途径的神经元凋亡，多研究了线粒体结构功能变化及其在凋亡中的作用，而对线粒体编码基因mRNA在缺血再灌注过程中的变化没有深入研究。作为细胞内唯一拥有DNA的细胞器，线粒体编码基因表达可能与核基因在缺血再灌注过程中不同，而且可能决定了线粒体在此过程中的重要作用。本研究就是针对缺血性神经元损害中线粒体编码基因表达这一领域，运用分子生物学方法，检测线粒体编码基因mRNA的表达，同时采用干预因素对线粒体基因表达进行影响，借此阐明缺血性神经元损害时线粒体基因表达特点及利害因素，探讨缺血性神经元凋亡的新机制，为神经元的再灌注损伤治疗提供理论依据和手段。 方法： 第四军医大学博士学位论文.........口旦..旦旦..口.................口.......口...里里旦旦旦里里口旦.国口. 1、用颈动脉分流法制备大鼠缺血/再灌注模型，选取海马CAI区神经元作为研究对象。建立线粒体体外转录、翻译体系，通过此体系对缺血及再灌注的海马CAI区神经元的线粒体RNA及蛋白质合成进行研究，以此了解缺血及再灌注对线粒体转录、翻译的影响。 2、应用PCR方法，对线粒体编码基因coxl、n、m和ATP合成酶6、9亚基的mRNA的表达进行测定。以此了解缺血及再灌注对线粒体编码基因表达的影响。 3、用高浓度外源性Al，P、高浓度腺昔及腺昔脱氨酶抑制剂、A2受体拮抗剂、L一肉毒碱及共辘亚油酸对线粒体的体外转录、翻译体系进行干预，并用PCR方法对线粒体编码基因coxl、11、In和ATP合成酶6、9亚基的mRNA的表达进行千预后测定，借此了解干预因素对线粒体编码基因表达的影响。结果: 1、缺血及缺血后再灌注都会影响线粒体mtDNA的转录、翻译，而且再灌注会加重此种损害。对缺血及再灌注对线粒体的转录和翻译进行比较研究时，发现在缺血时线粒体的转录功能下降了10.23%。翻译功能则下降了16.85%。在缺血时线粒体的翻译功能的下降程度要比转录功能的下降程度严重(P<0.05)。在缺血再灌注时，线粒体的转录功能又下降了14.62%。翻译功能则又下降了15.68%。两者下降的程度基本一致。 2、缺血脑性损害的确能够影响线粒体编码基因的表达，且这 种影响对各基因的影响效果不一致。对于Coxl，缺血会导致其 mRNA表达的降低，而再灌注会加重其mRNA表达的降低。而 对于Coxll来讲，缺血没有导致其mRNA表达的改变，再灌注第四军医大学博士学位论文 则上调Cox 11 mRNA表达。CoxlnmRNA的表达则相对稳定，缺 血及再灌注与正常对照组Coxlll mRNA的表达无明显差别 (P>0.05)。对于基因一ATPase6缺血损害则表现为对其mRNA 表达有下调作用(P<0 .01)，缺血再灌注则加强此作用。同时缺 血及再灌注对基因一ATPases的mRNA表达t无明显影响。 3、在有高浓度外源性八TP的情况下，缺血再灌注后线粒 体的RNA、蛋白质合成较缺血再灌注有进一步下降。易感的线 粒体编码基因一Cox 1 mRNA、Cox 11 mRNA、ATPase6 mRNA的 表达量均较缺血再灌注降低。不易感的基因一CoxlnmRNA、 ATPasesmRNA的表达量则无明显变化。 4、在高浓度腺昔时，加入腺昔脱氨酶抑制剂Erythro一9(2一hydroxy一3一nonl)adenine(EHNA)后，线粒体RNA、蛋白质体外合成及线粒体编码基因表达较缺血再灌注均无明显变化。加入A2受体拮抗剂喳哇琳后，线粒体RNA、蛋白质体外合成及线粒体编码易感基因表达较缺血再灌注均有提高(P<0.05)(P<0.01)。 5、加入正常脑组织核蛋白的缺血再灌注后线粒体RNA及蛋白质的体外转录、翻译体系中，脑线粒体RNA及蛋白质合成均较缺血再灌注条件下有提高，线粒体编码基因的表达也有提高(P<0 .05)。而加入缺血再灌注后脑组织核蛋白的线粒体RNA及蛋白质的体外转录、翻译体系则表现为线粒体RNA及蛋白质合成、线粒体编码基因较缺血再灌注表达的下降。 6、单独加入肉毒碱时，线粒体RNA、蛋白质合成均较缺血再灌注时有提高。线粒体编码易感基因表达也有提高。单独加入共扼亚油酞CoA时，线粒体RNA、蛋白质合成较缺血再灌注时无明显变化。两者联合加入时，线粒体RNA、蛋白质合成较单独加第四军医大学博士学位论文入肉毒碱时又有提高(P(0.05)。线粒体编码易感基因表达较单独加入肉毒碱时也有提高(P(0. 05>。 结论: 1、缺血脑损害会对线粒体的转录、翻译功能产生负面影响。在脑缺血时，翻译功能的下降严重于转录功能的下降。两者下降幅度不一致，说明尚有其它途径单独影响缺血时线粒体的翻译功能。在再灌注时，线粒体