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研究背景及目的程序性细胞死亡是一种受基因调控的细胞死亡方式,长期以来,凋亡被认为是程序性细胞死亡的唯一形式。相比之下,坏死被认为是外界物理或化学因素导致的偶然性细胞死亡,其形态学特征是细胞体积增大,细胞器肿胀,质膜破裂以及随后的细胞内容物溢出和丢失。然而近年来,随着其他具有坏死形态的程序性细胞死亡方式的发现,这一观点发生了改变。这些坏死性程序性细胞死亡包括坏死性凋亡,细胞焦亡和铁死亡等。与凋亡不同,坏死性凋亡是一种不依赖于含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)的程序性细胞死亡,由丝氨酸/苏氨酸激酶受体相互作用蛋白1(Receptor-interacting protein 1,RIPK1),受体相互作用蛋白3(Receptor-interacting protein 3,RIPK3)和混合谱系激酶结构域样蛋白(Mixed lineage kinase domain-like protein,MLKL)介导。细胞发生坏死性凋亡最终会导致细胞膜破裂并释放一系列与损伤相关的信号分子(Damage associated molecular patterns,DAMPs)从而激发炎症反应和器官损伤,因此坏死性凋亡与多种损伤性、炎症性、感染性疾病以及肿瘤的发生发展均关系密切。在这些疾病中,急性肾损伤表现为肾脏滤过功能迅速下降,其病理特征是肾小管细胞坏死。它可由肾毒性药物如肿瘤化疗药物顺铂、缺血再灌注等多种因素诱导。近年研究表明坏死性凋亡在急性肾损伤过程中发挥重要作用。已有研究表明,顺铂或肾缺血再灌注诱导的急性肾损伤病变程度在RIPK3或MLKL基因敲除的小鼠模型中明显减轻。除急性肾损伤外,在实体肿瘤发展过程中,由于缺氧和葡萄糖缺乏等代谢应激,通常其中心区域可见肿瘤坏死。多年来研究发现这种类型的坏死与肿瘤发生和不良预后均相关。然而,由于缺乏对细胞坏死分子机制的了解,坏死在肿瘤进展过程中的作用仍然很大程度上未知。由于坏死性凋亡在形态上与坏死相似,因此坏死性细胞凋亡是否参与了肿瘤坏死并在肿瘤发生发展中起着重要作用是当前的研究热点。2018年我们研究组在《Cell Research》杂志报道了坏死性凋亡在小鼠乳腺癌坏死区域普遍存在,且这种坏死性凋亡的发生促进了乳腺癌的肺转移。由于坏死性凋亡与肿瘤等炎症相关性疾病的发生发展均关系密切,因此发现能够抑制坏死性细胞凋亡的药物对于炎症性疾病及肿瘤疾病的治疗具有重要意义。目前已经基于RIPK1,RIPK3和MLKL研发出了多个创新性先导药物,然而,目前这些药物依然存在药效不足、代谢稳定性较差、细胞毒性强等诸多问题,限制了其进一步的临床试验及应用。因此,筛选及鉴定出新型坏死性凋亡小分子抑制剂对于肿瘤等炎症相关性疾病的干预和治疗均有很大的潜在价值。本研究计划首先从相关小分子库中筛选出有效的新型坏死性凋亡小分子抑制剂,然后开展这些新筛的抑制剂在肿瘤等炎症相关性疾病中的活性作用研究。这些研究旨在阐明坏死性凋亡在肿瘤等炎症相关性疾病中的具体作用和生物学机制,并评估新型坏死性凋亡小分子抑制剂的潜在应用价值,从而为坏死性细胞凋亡相关疾病的干预治疗提供新的思路和靶点。研究方法1、在含氟化合物库和Bcr-Abl抑制剂中进行筛选,诱导HT-29细胞发生坏死性凋亡,并用MTT法或Cell Titer-Glo荧光细胞活性检测试剂盒测定各化合物干预后的细胞存活率,从而筛选出有效的候选新型坏死性凋亡抑制剂。2、通过蛋白免疫印迹,免疫共沉淀、药物亲和反应靶标稳定性分析、体外激酶实验、分子对接分析等明确筛选出的新型小分子化合物抑制坏死性凋亡的分子机制。3、通过建立小鼠全身炎症反应综合征(Systemic inflammatory response syndrome,SIRS)模型、小鼠乳腺癌细胞肺转移模型、顺铂和肾缺血再灌注诱导的小鼠急性肾损伤模型,研究新型坏死性凋亡抑制剂是否在坏死性凋亡相关疾病模型中具有保护作用。实验结果1、我们发现含氟化合物TAK-632有效地保护了TNF-α、Smac mimetic和Z-VAD-FMK(TSZ)诱导的坏死性凋亡。同时,其对TNF-α诱导的SIRS有明显的保护作用。2、TAK-632的衍生化合物“化合物42”通过靶向抑制RIPK3激酶活性而抑制坏死性凋亡。在小鼠SIRS模型中,5mg/kg口服剂量的化合物42有明显的保护作用,其相比TAK-632更为有效。3、化合物42对MVT-1乳腺癌生长无明显影响,但能显著抑制小鼠乳腺癌的肺转移。4、我们发现Bcr-Abl抑制剂GNF-7有效地保护了TSZ诱导的坏死性凋亡。在分子机制上,GNF-7通过靶向抑制RIPK1和RIPK3激酶活性抑制坏死性细胞凋亡5、GNF-7在顺铂和肾缺血再灌注诱导的小鼠急性肾损伤模型中通过抑制坏死性凋亡、减轻肾脏组织炎症反应从而抑制了小鼠的急性肾损伤程度。实验结论本研究以TAK-632为先导化合物合成的第42号衍生物是一种针对RIPK3激酶的新型坏死性凋亡抑制剂,而GNF-7则是针对RIPK1和RIPK3激酶的双激酶抑制剂。我们进一步证明了化合物42可以有效抑制小鼠乳腺癌肺转移,而GNF-7通过抑制坏死性凋亡减轻了顺铂和肾缺血再灌注诱导的急性肾损伤。此研究不仅发现了新的坏死性细胞凋亡抑制剂,而且为进一步探索坏死性凋亡在肿瘤等炎症性疾病中的生物学机制提供了新的工具和思路。