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本文主要从以下几个方面展开:
第一部分小鼠血管灌注造影视网膜铺片操作技术及技巧探讨
目的:
探讨一种简单且易于规范操作的小鼠血管灌注造影视网膜铺片操作技术方法。
方法:
30只生后12~17天C57BL/6J小鼠麻醉后行2%伊文蓝上腔静脉灌注,5min后处死,摘取眼球,4%多聚甲醛固定,A组20只眼球固定10min,B组20只眼球固定20min,C组20只眼球固定40min,手术显微镜下去除角膜、虹膜、晶状体、玻璃体及巩膜并将视网膜平铺于载玻片上,荧光显微镜下照相,观察其差异。
结果:
大体观察A组视网膜变大变薄变形,视网膜面积明显扩大;B组视网膜无变形,保持原有的形态;C组视网膜见黑色素黏附视网膜外层,不易分离。荧光显微镜下照相观察A组视网膜血管模糊变形不清,B组视网膜血管均匀规则分布,C组视网膜黑色色素上皮层部分黏附,血管背景成像不均匀。
结论:
良好的规范操作技巧和恰当的多聚甲醛固定时间是保证小鼠血管灌注造影视网膜铺片成功的关键。
第二部分血管能抑素基因对小鼠视网膜新生血管作用的实验研究
目的:
观察血管能抑素真核表达质粒(pCMV-HA)对小鼠视网膜新生血管形成的抑制作用。
方法:
56只C57BL/6J新生小鼠随机分为正常对照组、氧诱导视网膜病变(OIR)模型组、治疗组和空载体组,每组14只。后3组小鼠置于(75±2)%浓度的氧环境中饲养5 d后,回到正常空气环境中建立氧诱导的视网膜新生血管动物模型。治疗组小鼠在出生后第12天出氧箱时行玻璃体腔注射血管能抑素pCMV-HA,空载体组注射等量空质粒。出生后第17天行伊凡思蓝(Evans blue)灌注血管造影视网膜铺片观察血管变化。石蜡切片行苏木精-伊红(HE)染色,光学显微镜镜下观察并计数突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核数。
结果:
视网膜铺片结果显示,治疗组较OIR模型组和空载体组视网膜血管分布均匀,新生血管和无灌注区显著减少。治疗组突破内界膜的内皮细胞核数目与OIR模型组及空载体组比较,组间差异具有统计学意义(F=39.006,P<0.001)。
结论:
血管能抑素pCMV-HA对氧诱导的视网膜新生血管有显著的抑制作用。
第三部分血管能抑素蛋白对小鼠视网膜新生血管作用的实验研究
目的:
探讨重组血管能抑素(canstatin)蛋白对小鼠视网膜新生血管形成的抑制作用。
方法:
将42只7日龄的C57BL/6J新生鼠随机分为正常对照组(14只)、OIR模型组(14只)和治疗组(14只),后两组置于氧浓度为(75±2)%的高氧环境中饲养5天后,回到正常空气环境中建立氧诱导的视网膜新生血管动物模型。治疗组在生后第12天出氧箱时行玻璃体腔注射canstatin蛋白1μl(500ng/μl),对侧眼注射相同体积的生理盐水(normal saline.NS)作为对照。出生后第17天行伊文思蓝灌注血管造影视网膜铺片观察血管变化。石蜡切片行HE染色,光镜下观察并计数突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核数目。
结果:
视网膜铺片结果显示,治疗组较高氧组血管分布均匀,新生血管和无灌注区显著减少。治疗组突破内界膜的内皮细胞核数目(11.3±1.47)与高氧组(32.73±6.38)相比,显著减少(P<0.001)。
结论:
重组canstatin蛋白能有效抑制氧诱导的视网膜新生血管的生成。