滚环扩增(Rolling Circle Amplification, RCA)是以环状DNA为模板,使用DNA聚合酶,一般使用随机引物的一种扩增方式。现在被广泛用于扩增痕量模板,特别是单细胞的全基因组扩增(Whole Genome Amplification, WGA).在RCA的应用中主要涉及两个技术难题,即1)污染控制问题以及2)模板高级结构对反应效率影响的问题。RCA反应中长期没有解决的问题是,存在污染。这种污染体现在目标模板拷贝数极低的情况下,DNA聚合酶可以合成与目标模板毫无相关性的产物。这种现象被命名为非模板依赖性扩增(Template Independent Amplification, TIDA)。可以想见,RCA产物中TIDA产物较高时,会严重影响目标分子的扩增,有的时候甚至出现目标分子无扩增或效率很低的现象,因而TIDA的出现无疑会影响后续的实验和分析,造成实验的失败。迄今为止,一些研究组的研究也涉及到TIDA相关的内容,尚并没有明确TIDA的来源。为了提高RCA的效率,本研究的目的之一是鉴定TIDA的模板来源。为了获取RCA中非模板依赖性扩增的序列以及确定其来源,本研究采取克隆及测序的技术路线进行分析研究。通过对TIDA的酶切获取非模板依赖性扩增的片段,构建出带有该类片段的质粒,通过直接的克隆及测序获取TIDA的序列。最终得6个是阳性克隆,比对结果显示与红球菌属(Rhodococcus equi 及 Rhodococcus erythropolis)、伊丽莎白菌属(Elizabethkingia)、Phenylobacterium zucineum、红环菌属(Rubrivivax gelatinosus)以及粪壳菌属(Sordaria macrospora)的特异基因具有高度的相似度。其中红球菌属、伊丽莎白菌属、Phenylobacterium zucineum、以及红环菌属属于真细菌纲,粪壳菌属则属于真菌纲。上述真细菌纲以及真菌纲的物种的共同特点是,均可以从土壤中分离,因此,我们推断：TIDA来源于实验室中的飞尘。在RCA反应中,环状分子作为模板时,可以获得较高的扩增效率。本研究关注作为RCA反应的DNA模板的高级结构,从模板高级结构的角度研究影响RCA效率的关键因素。本研究首先建立了短时间的RCA反应,可以大大提高针对RCA扩增效率监测的精密度。分别使用不同长度的质粒(环式分子)作为模板,通过RCA产物及其限制片段的观察,我们发现随着长度的增加,环式分子的扩增效率有下降的趋势。基于此,我们得出这样的结论：分子的长度可以严重影响RCA的扩增效率。本研究建立了可以高质量再现TIDA的RCA反应体系,鉴定了TIDA的来源,即TIDA来自实验室的飞尘。因此,我们提出,通过RCA方式建库完成二代测序后,可以根据上述的TIDA来源进行数据的过滤有效地提高数据的准确性及避免对病原微生物的误判。另外,根据TIDA来源,采取相应的措施,降低来自实验室污染对实验造成的影响。此外,对于模板影响RCA扩增效率的讨论无疑将对有效提高RCA反应效率颇有裨益,为优化RCA反应提出了可数字化的优化方案。