论文部分内容阅读
ε-聚赖氨酸(ε-PL)是天然存在的一类聚氨基酸,具有对细菌、酵母菌、霉菌的广谱抗性,且安全无毒、水溶性好、热稳定性高。作为逐渐被推广使用的食品防腐剂,其抗菌的分子机制尚未清晰阐明。本论文通过微生物培养,原子力显微镜(AFM)和透射电子显微镜(TEM)观察,抑制消减杂交文库筛选,实时定量PCR和基因敲除等技术,并根据不同技术选取适合的研究对象,对ε-PL抑制典型致病菌(食源性、医源性)的现象和分子机制进行了深入的研究。最后采用PCR-DGGE技术,评估了口服ε-PL对小鼠肠道微生态菌群的影响。论文分为六个章节。第一章对食品防腐剂,尤其是天然防腐剂的分布、性质、特性进行了描述,重点对天然微生物抗菌剂ε-PL的理化性质、抗菌活性及机制,应用范围和发展方向进行了系统的阐述。在第二章中,以Escherichia coli O157:H7为模式微生物,系统探讨了ε-PL对致病菌的抑菌活性和分子机制。结果发现ε-PL拮抗E. coli0157:H7的活性随温度的升高(4℃、25℃和37℃)和处理时间的延长(0-15h)递增;在pH5-7环境中抑菌活性没有显著变化,在pH大于8时活性降低。AFM和TEM观察结果表明,-PL能破坏细胞膜的结构,形成膜穿孔,使胞质呈不均匀分布,细胞内容物泄漏。ε-PL能诱导细菌内活性氧的产生,且其浓度随着ε-PL浓度的增加而升高。RT-qPCR检测结果表明,ε-PL能对细菌产生氧胁迫,损伤细菌DNA,并抑制E.coli0157:H7的侵染毒力。为进一步研究ε-PL的抑菌分子机理,探讨其对致病菌的基因调控影响,在第三章中以常见感染且难以抑杀的条件致病菌-白色念珠菌(Candida albicans ATCC14053)为研究对象,采用SSH技术对ε-PL抑菌前后的差异基因进行了筛选。RT-qPCR验证结果显示,在ε-PL亚致死浓度胁迫下,C. albicans有10个发生差异表达的基因,表明ε-PL能通过降低糖酵解和脂类代谢相关基因的表达,抑制C. albicans的糖代谢并导致C. albicans中脂类代谢的紊乱。蛋白质合成相关基因GCN1?精氨酸tRNA合成酶及泛素蛋白连接酶Asi3的上调表达则表明,ε-PL的抑菌活性能破坏细胞结构,并促进C. albicans蛋白的降解。通过基因敲除造成基因缺失是进一步验证ε-PL抑菌分子机制的有效方法。肠炎沙门氏菌是污染食品的主要食源性致病菌,其双组分信号转导系统以特定的方式调控沙门氏菌的毒力,抵抗抗菌肽的抑菌作用。基于沙门氏菌的基因敲除系统有方法成熟,且操作简单的优势,在第四章中,通过敲除S. enteritidis中抵抗抗菌肽的调控系统PhoP-PhoQ和RcsFCDB中的关键基因PhoP和rcsF,比较了ε-PL对S. enteritidis野生株和基因敲除株的相关基因表达影响的差异,探讨其抑制S. enteritidis的分子机制。结果显示S. enteritidisΔphoP对ε-PL的敏感性显著增加,且PhoP-PhoQ所调控的下游基因的表达显著下降,而S. enteritidisΔrcsF在ε-PL中的生长速率较之野生株没有显著差异,表明PhoP-PhoQ调控系统在S. enteritidis抵抗ε-PL的过程中起到关键性的作用,而RcsFCDB调控系统则不能被£-PL激活。ε-PL作为食品防腐剂,是否会对机体肠道微生态菌群平衡造成影响,未见报道。在第五章中,采用PCR-DGGE和RT-qPCR相结合的方法,分析了灌胃ε-PL两周过程中小鼠粪便中菌群结构和数量的变化。结果显示,乳杆菌属菌群多样性有所增加。乳杆菌属、拟杆菌属和肠杆菌属的菌体数量所占比例无显著性变化,提示ε-PL小会影响小鼠肠道菌群的平衡,具有一定的食用安全性。