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雪椿(Camellia.japonica var.decumbens)是山茶花(C.japonica)的一个自然变种,为常绿阔叶小乔木,原生地在日本,主要分布在岩手县、秋田县和滋贺县的北部,多生长在本州海岸的山间及多雪的地方。雪椿枝株姿形优美,叶色浓绿而有光泽,花色艳丽缤纷,往往迎雪盛开。山茶花可孤植,群植,盆栽用于观赏,还可用于庭园,专类园和园林绿化。此外山茶花的花和种子还有较高的药用价值,种子还可提取茶花精油。因此山茶花不仅具有较高的观赏价值,还有经济应用价值。但由于山茶花喜温暖湿润,多分布在长江流域,受温度限制很难在北方地区生长。而分布在日本高纬度(39°N)地区的雪椿,可在冬季盛开美丽的花朵,是研究山茶花低温适应的理想优质材料。本研究以日本引种的雪椿作为试验材料,通过生境气候调查,生理生化分析,转录组测序分析,从表型到内部结构再到分子水平研究雪椿叶片对低温胁迫的响应机制,结果总结如下,
(1)为探明雪椿引种到郑州的可行性,根据‘气候相似性“原理,针对雪椿的种源地和引种地4个城市的气温、降水量和相对湿度等气候因素进行调查和分析。结果表明:郑州和雪椿种源地的温度和湿度不存在显著性差异,降水量存在显著性差异。因此引种到郑州的雪椿,需要通过必要的控水管理,才可以逐渐适应当地气候。
(2)以津市(雪椿1号)、东京(雪椿5号)和盛冈(雪椿9号)3个种源雪椿的叶片为材料,在郑州自然低温条件下测定越冬期内叶片的生理生化指标,结合石蜡切片技术测定叶片解剖结构指标,并采用电导法配合Logistic方程计算低温半致死温度(LT50),对雪椿的抗寒性进行综合评价并比较3个种源雪椿的抗寒性。结果表明:3个种源雪椿的生理生化指标和叶片解剖结构指标存在差异,雪椿1号,5号和9号的低温半致死温度分别为-10.61℃,-9.8℃和-11.93℃。通过生理生化指标的主成分分析及方差分析发现,叶绿素含量、可溶性蛋白含量和POD酶活性与雪椿的抗寒性密切相关,较高的叶绿素含量和可溶性蛋白的积累是雪椿9号具有较好的抗寒性的一个重要原因;通过叶片解剖结构指标的观测及方差分析可知,雪椿9号的栅栏组织厚度、上表皮厚度和细胞结构紧密度(CTR)与雪椿1号和5号存在显著性差异,均高于后两者,并且雪椿9号具有2层栅栏组织,是雪椿9号表现出较好的抗寒性的另一原因。综合分析各试验结果后,得出3个种源雪椿的抗寒能力依此为雪椿9号>雪椿1号>雪椿5号。
(3)以耐冬和雪椿为材料,通过自然低温和人工气候室控制低温(4、0、-4、-8、-12℃)2种处理方法,测定低温过程中样本叶片生理生化指标的变化,结合低温半致死温度以及隶属函数评价方法,探讨耐冬和雪椿的抗寒性及其生理响应机制。结果表明,耐冬和雪椿叶片中各物质的变化规律基本相似,随着低温胁迫的加剧,耐冬的叶绿素含量始终高于雪椿,且自然胁迫波动性较大;可溶性蛋白、POD酶活性和CAT酶活性均是先下降,当达到一定阈值后开始上升。但耐冬和雪椿生理指标的阈值存在差异,耐冬可溶性蛋白和POD酶活性在-8℃低温处理后开始上升,雪椿的可溶性蛋白和POD酶活性都在0℃低温处理后开始上升,而耐冬和雪椿的CAT酶活性都在4℃低温处理后就开始上升。经自然低温处理后耐冬的低温半致死温度为-14.08℃,雪椿的为-11.93℃,结合隶属函数综合评价,初步认为耐冬的耐寒性优于雪椿。
(4)分析了低温胁迫时冷应激引起的雪椿转录组学变化。在以25℃(T1)处理为对照,通过0℃,4℃,-8℃和-12℃(T3,T5,T7和T9)进行低温胁迫下雪椿叶片转录组研究中,T3/T1,T5/T1,T7/T1和T9/T1这4个比较组中差异上调表达的基因分别为2828,2384,3099和3075个,差异下调表达的基因分别为3184,22592,2373和2615个。通过GO注释和GO富集对这些基因进行分析可知,这些基因的功能主要是刺激、代谢过程、催化活性或结合的反应。这些差异表达的基因中,有67与低温胁迫调控相关基因被选出,包括26个冷响应转录因子,17个参与冷传感器或信号转导基因和24个参与质膜稳定和渗透反应基因。可知分子调控机制在雪椿低温胁迫时通过信号转导,渗透调节快速的做出应激反应。
(1)为探明雪椿引种到郑州的可行性,根据‘气候相似性“原理,针对雪椿的种源地和引种地4个城市的气温、降水量和相对湿度等气候因素进行调查和分析。结果表明:郑州和雪椿种源地的温度和湿度不存在显著性差异,降水量存在显著性差异。因此引种到郑州的雪椿,需要通过必要的控水管理,才可以逐渐适应当地气候。
(2)以津市(雪椿1号)、东京(雪椿5号)和盛冈(雪椿9号)3个种源雪椿的叶片为材料,在郑州自然低温条件下测定越冬期内叶片的生理生化指标,结合石蜡切片技术测定叶片解剖结构指标,并采用电导法配合Logistic方程计算低温半致死温度(LT50),对雪椿的抗寒性进行综合评价并比较3个种源雪椿的抗寒性。结果表明:3个种源雪椿的生理生化指标和叶片解剖结构指标存在差异,雪椿1号,5号和9号的低温半致死温度分别为-10.61℃,-9.8℃和-11.93℃。通过生理生化指标的主成分分析及方差分析发现,叶绿素含量、可溶性蛋白含量和POD酶活性与雪椿的抗寒性密切相关,较高的叶绿素含量和可溶性蛋白的积累是雪椿9号具有较好的抗寒性的一个重要原因;通过叶片解剖结构指标的观测及方差分析可知,雪椿9号的栅栏组织厚度、上表皮厚度和细胞结构紧密度(CTR)与雪椿1号和5号存在显著性差异,均高于后两者,并且雪椿9号具有2层栅栏组织,是雪椿9号表现出较好的抗寒性的另一原因。综合分析各试验结果后,得出3个种源雪椿的抗寒能力依此为雪椿9号>雪椿1号>雪椿5号。
(3)以耐冬和雪椿为材料,通过自然低温和人工气候室控制低温(4、0、-4、-8、-12℃)2种处理方法,测定低温过程中样本叶片生理生化指标的变化,结合低温半致死温度以及隶属函数评价方法,探讨耐冬和雪椿的抗寒性及其生理响应机制。结果表明,耐冬和雪椿叶片中各物质的变化规律基本相似,随着低温胁迫的加剧,耐冬的叶绿素含量始终高于雪椿,且自然胁迫波动性较大;可溶性蛋白、POD酶活性和CAT酶活性均是先下降,当达到一定阈值后开始上升。但耐冬和雪椿生理指标的阈值存在差异,耐冬可溶性蛋白和POD酶活性在-8℃低温处理后开始上升,雪椿的可溶性蛋白和POD酶活性都在0℃低温处理后开始上升,而耐冬和雪椿的CAT酶活性都在4℃低温处理后就开始上升。经自然低温处理后耐冬的低温半致死温度为-14.08℃,雪椿的为-11.93℃,结合隶属函数综合评价,初步认为耐冬的耐寒性优于雪椿。
(4)分析了低温胁迫时冷应激引起的雪椿转录组学变化。在以25℃(T1)处理为对照,通过0℃,4℃,-8℃和-12℃(T3,T5,T7和T9)进行低温胁迫下雪椿叶片转录组研究中,T3/T1,T5/T1,T7/T1和T9/T1这4个比较组中差异上调表达的基因分别为2828,2384,3099和3075个,差异下调表达的基因分别为3184,22592,2373和2615个。通过GO注释和GO富集对这些基因进行分析可知,这些基因的功能主要是刺激、代谢过程、催化活性或结合的反应。这些差异表达的基因中,有67与低温胁迫调控相关基因被选出,包括26个冷响应转录因子,17个参与冷传感器或信号转导基因和24个参与质膜稳定和渗透反应基因。可知分子调控机制在雪椿低温胁迫时通过信号转导,渗透调节快速的做出应激反应。