目的:头颈部鳞癌占全身恶性肿瘤的第六位,是头颈部最常见的恶性肿瘤。区域性淋巴结转移的特性是导致头颈鳞癌患者预后不良的主要原因之一。详细的阐明头颈鳞癌细胞侵袭转移分子机制、寻找临床干预因子,对于头颈鳞癌的临床靶向治疗来说具有十分重要的意义。转录因子SP1是具有锌指结构的转录因子,在包括乳腺癌、胃癌、胰腺癌、肺癌及甲状腺癌等肿瘤中表达升高,并且其表达水平与患者临床分期、肿瘤侵袭情况及患者的预后等临床特征均显著相关。SP1能够通过调控p53,VEGF,PDGF,MDC1,MMP-9等分子参与调节细胞增殖、侵袭、转移、凋亡、血管生成以及DNA损伤修复和细胞应激反应等。Micro RNA是一组小的内源性非编码RNA,长度在21-25个核苷酸之间,他们通过识别特定的m RNA 3’-UTR序列并与之结合,在转录后水平促进其降解或抑制其表达而发挥生物调控作用。MiR-92b是miR-17-92基因簇的一员,在大部分癌症相关的研究中,miR-92b扮演着肿瘤促进因子的作用,比如在在口腔癌中miR-92b能够通过调控NLK的表达促进细胞增殖、抑制凋亡等等。趋化因子受体CCR7是G-蛋白偶联受体家族的一员,通过与其两个配体CCL19及CCL21相互作用起到促进细胞侵袭迁移等生物学行为的作用。我们在对头颈鳞癌淋巴结转移机制研究过程中,证实了CCR7能够通过调控下游PI3K/Akt/m TOR、Cdc42、Rac、p70s6k、MAPK家族、pyk2及STAT3等分子的表达起到对头颈鳞癌细胞侵袭和迁移能力的调节作用。在本研究中我们主要研究了miR-92b在头颈鳞癌中的生物学功能,miR-92b与转录因子SP1的相互调控关系,以及SP1/miR-92b信号轴对CCR7分子的调控作用,以进一步完善头颈鳞癌侵袭及转移的分子机制,为头颈鳞癌的临床靶向治疗提供一定的理论基础依据。研究方法:1.检测miR-92b在头颈鳞癌细胞及组织标本中的表达水平。通过基因芯片检测miR-92b在两对头颈鳞癌细胞系PCI-4A/4B及PCI-37A/37B细胞中的表达水平,并通过Real-time PCR实验进行验证。通过下载及分析TCGA数据库中头颈鳞癌患者基因表达数据表达miR-92b在头颈鳞癌癌旁、癌及转移灶中的表达水平。1.Detecting miR-92b levels in HNSCC cells and specimens We detected miR-92b levels in two pairs of HNSCC cells PCI-4A/4B and PCI-37A/37B by microarray,and verified the results by Real-time PCR.By analyzing HNSCC patients gene expression data in TCGA database,we compared the miR-92b levels in the adjacent normal tissue,primary focus and metastasis.2.MiR-92b表达与头颈鳞癌患者临床分期及预后相关性分析分析TCGA数据库头颈鳞癌患者基因表达数据,比较不同临床分期患者及有无淋巴结转移患者病灶组织中miR-92b的表达水平。通过ROC曲线将患者分为miR-92b高表达及低表达组,通过Kaplan-Meier曲线分析两组患者生存时间差异,采用Log-rank检验。应用Mann-Whitney检验分析miR-92b表达水平与头颈鳞癌患者临床特征相关性,采用单因素及多因素Cox比例风险回归模型分析头颈鳞癌患者死亡相关风险因素。2.Analysing the relationship between miR-92b expression and clinical stage and prognosis of HNSCC patients By analyzing TCGA data,we compared miR-92b levels in HNSCC patients with different clinical stages and lymph node metastasis status.By using ROC curve we divided HNSCC patients into high miR-92b expression group and low expression group.Kaplan-Meier curve was used to compare survival days of the patients and was tested by Log-rank test.By using Mann-Whitney test we analyzed the correlation between miR-92b levels and clinical features of HNSCC patients.Univariate and multivariate Cox-proportional hazards model were used to analyzed the death-related risk factors of HNSCC patients.3.MiR-92b对头颈鳞癌细胞侵袭迁移及增值能力的影响通过细胞转染技术向头颈鳞癌细胞PCI-37A/37B转染RNA Oligo:miR-92b mimics,inhibitor以及negative control调节细胞中miR-92b的表达水平。通过transwell迁移实验及划痕愈合实验检测各转染组细胞迁移能力,通过transwell侵袭实验检测各转染组细胞侵袭能力,通过CCK8细胞增殖实验检测各转染组细胞增殖能力。3.Evaluating the effect of miR-92b expression on migration,invasion and proliferation of HNSCC cells By using cell transfection technique we transfected RNA Oligo-miR-92b mimics, inhibitor and negative control into PCI-37A/37B to regulate its expression.Transwell migration assay and wound healing assay were used to compare migratory abilites of each transfection group.Transwell invasion assay was used to detect cell invasive ability.CCK8 cell proliferation assay was used to detect cell proliferation.4.MiR-92b对SP1表达调控作用分析通过分析TCGA数据库头颈鳞癌患者表达数据分析SP1表达与miR-92b表达水平相关性。通过细胞转染技术上调/下调头颈鳞癌细胞PCI-37A/37B中miR-92b表达水平,通过Real-time PCR检测各转染组细胞中SP1 m RNA表达水平,通过Western blot技术检测各转染组中SP1蛋白表达水平。4.Evaluating SP1 regulation from miR-92b By analyzing TCGA data we analyzing the relationship between SP1 and miR-92b expression levels.MiR-92b levels in PCI-37A/37B cells was regulated by using cell transfection.SP1 m RNA levels were used by Real-time PCR,and SP1 protein levels were detected by Western blot.5.SP1对CCR7表达的调控作用通过分析TCGA数据库头颈鳞癌患者表达数据分析CCR7表达与SP1表达水平相关性。通过细胞转染技术向头颈鳞癌细胞PCI-37A/37B中转染SP1 siRNA。通过Real-time PCR检测各转染组细胞中SP1及CCR7 m RNA表达水平,通过Western blot检测各转染组中SP1及CCR7的蛋白表达水平。5.Evaluating CCR7 regulation from SP1By analyzing TCGA data we analyzing the relationship between CCR7 and SP1expression levels.SP1 siRNA was transfected into PCI-37A/37B cells to down-regulating its levels.Real-time PCR was used to detect SP1 and CCR7 m RNA levels.Western blot was used to detect SP1 and CCR7 protein levels.6.MiR-92b对CCR7表达调控作用分析通过细胞转染技术上调/下调头颈鳞癌PCI-37A/37B细胞中miR-92b的表达水平,通过Real-time PCR检测各转染组细胞中CCR7 m RNA表达水平,通过Western blot检测各转染组细胞中CCR7的蛋白表达水平。通过双荧光素酶报告基因验证miR-92b与CCR7 m RNA 3’-UTR序列的结合作用。通过细胞共转染技术同时向头颈鳞癌细胞PCI-37A/37B中转染SP1 siRNA及质粒载体miR-92b inhibitor以及相应阴性对照。通过Real-time PCR检测各转染组细胞中miR-92b,SP1及CCR7 m RNA表达水平,通过Western blot技术检测各转染组细胞中CCR7蛋白表达水平。6.E7.SP1/miR-92b/CCR7信号通路作用关系体内实验验证通过向头颈鳞癌细胞感染慢病毒载体构建稳定低表达SP1头颈鳞癌细胞株,分为SP1敲低组、SP1对照组及空白对照组细胞,皮下接种于BALB/c-nu裸鼠进行成瘤实验,观察各组裸鼠瘤组织生长速度及最终成瘤大小。接种后25天处死各组裸鼠获取成瘤组织比较大小,通过Real-time PCR实验检测各组瘤组织中miR-92b的表达量,将瘤组织制作石蜡切片,通过免疫组化检测各组成瘤组织中SP1及CCR7蛋白表达水平。结果:1.MiR-92b在头颈鳞癌细胞系中的表达前期芯片结果显示miR-92b在具有较高侵袭迁移能力的PCI-4B及PCI-37B细胞中表达水平较高。Real-time PCR检测结果验证了这一表达差异。对TCGA数据库数据分析显示miR-92b在头颈鳞癌原发灶中表达高于癌旁组织,在转移灶中表达水平又高于原发灶中表达水平。2.MiR-92b与头颈鳞癌患者的临床分期及预后相关性通过对TCGA数据库数据分析发现,miR-92b在临床分期III期及IV期的患者中表达水平高于I期及II期患者,在有淋巴结转移的头颈鳞癌患者中的表达水平高于无淋巴结转移的患者。高表达miR-92b组的头颈鳞癌患者生存时间较短。同时miR-92b的表达水平与患者N分期具有相关性,N分期及miR-92b高表达是头颈鳞癌患者的死亡相关风险因素。3.MiR-92b对头颈鳞癌细胞迁移、侵袭及增殖能力影响向头颈鳞癌细胞中转染了miR-92b mimics及inhibitor后,细胞中miR-92b的表达出现相应的上调及下调。Transwell迁移实验及划痕愈合实验结果表明miR-92b表达升高后,头颈鳞癌细胞迁移能力显著提高,miR-92b表达降低后,细胞迁移能力下降。Transwell侵袭实验结果表明miR-92b表达升高后,细胞侵袭能力显著增高,而敲低miR-92b后细胞侵袭能力明显下降。CCK-8实验结果表明,上调miR-92b表达后细胞增殖能力提升,而下调miR-92b表达后细胞增殖能力下降。4.MiR-92b对SP1表达调控作用分析TCGA数据库数据,SP1在头颈鳞癌标本中表达随miR-92b表达升高而升高。在头颈鳞癌细胞中上调miR-92b后,SP1 m RNA及蛋白的表达升高,而下调细胞中miR-92b表达后,SP1 m RNA及蛋白表达水平均下降。5.SP1对CCR7的表达调控作用分析分析TCGA数据库数据,在头颈鳞癌患者标本中CCR7的表达随SP1表达水平升高而升高。在头颈鳞癌细胞中转染SP1 siRNA降低其表达后,CCR7 m RNA及蛋白表达水平均下降。6.MiR-92b对CCR7表达调控作用分析在头颈鳞癌细胞中上调miR-92b表达后,CCR7 m RNA表达水平下降,下调miR-92b表达后,CCR7 m RNA表达水平上升。荧光素酶实验证实miR-92b能够与CCR7 m RNA 3’-UTR序列结合进而下调其表达,而这一调控作用在蛋白水平明显减弱。同时下调头颈鳞癌细胞中SP1和miR-92b的表达,与单独降低SP1表达相比CCR7 m RNA及蛋白的表达水平有所回升。7.SP1/miR-92b/CCR7信号通路作用关系体内实验验证构建SP1敲低慢病毒载体,感染头颈鳞癌细胞PCI-37B。分别使用空白对照组细胞、SP1对照组细胞以及SP1敲低组细胞进行裸鼠体内成瘤实验。结果与对照组相比SP1敲低组肿瘤生长速度明显减慢,成瘤体积减小。在SP1敲低组成瘤组织中,miR-92b表达水平降低,CCR7蛋白表达水平亦下降。结论:MiR-92b能够促进头颈鳞癌细胞迁移、侵袭以及增殖过程,并且与头颈鳞癌患者的临床特征、临床分期及预后有关。转录因子SP1及miR-92b在头颈鳞癌细胞中形成互相促进的正反馈调节环路。SP1/miR-92b反馈环路总体对CCR7的表达起到促进作用,其中SP1起到主要的上调作用,而miR-92b对CCR7具有微弱的下调作用。