生育三烯酚作为维生素E的重要成分,是一种极好的抗氧化剂,具有降低胆固醇、保护神经和抗辐射以及抗癌等多种功能,在医药保健品、食品、饲料和化妆品等领域有广泛的应用价值。由于化学合成路线过于复杂,目前市场上生育三烯酚的供应依赖于植物提取,存在占用土地资源、破坏生态等问题。构建工程微生物细胞工厂,进行生育三烯酚生物合成,是一种极具潜力的替代生产途径。为了实现生育三烯酚的高效生物合成,本文以酿酒酵母为操作平台,开展生物合成途径的综合改造与调控研究,通过强化前体供应、重建氧化还原平衡等途径优化策略来促进酿酒酵母合成生育三烯酚,并通过原位萃取体系的构建和内源性Pleiotropic Drug Resistance（PDR）蛋白的挖掘来探索生育三烯酚的分泌生产。首先,以前期构建的产生育三烯酚酿酒酵母菌株YSM5为出发菌株,通过敲除全局转录因子编码基因MOT3或ROX1,解除其对甲羟戊酸（MVA）途径和麦角甾醇合成基因的抑制,增强生育三烯酚合成过程中MVA途径衍生前体的供应。其次,过表达红法夫酵母来源的香叶基香叶基焦磷酸（GGPP）合酶突变体（CrtE03M）促进GGPP的合成,使角鲨烯含量下降了38.35%,中间体2-甲基-6-香叶基香叶基苯醌（MGGBQ）和2,3-二甲基-5-香叶基香叶基苯醌（DMGGBQ）的总量增加了25.60%,生育三烯酚产量达到17.22 mg/g DCW,约为YSM5的3.48倍。考虑到tHMG1的过表达可能会扰乱宿主中的辅因子平衡,通过过表达线粒体NADH激酶POS5提高了胞内NADPH/NADH比值,进一步增加生育三烯酚的产量,达到17.92 mg/g DCW。最后,从菌株中同时敲除MOT3和ROX1,所得菌株YVT17中生育三烯酚产量达到19.24 mg/g DCW,比起始菌株 YSM5提高了 290%。生育三烯酚等亲脂性化合物由于其疏水性,往往储存在细胞膜中,这可能会对酵母细胞产生压力。此外,细胞内有限的膜结构也可能限制其产量。如果能够将生育三烯酚分泌到培养基中,则有望缓解由于膜储存引起的细胞应激并扩大其储存空间,同时大幅简化下游加工程序。为了使生育三烯酚在生产过程中分泌到胞外,以不同的有机溶剂为萃取剂,建立了菌株YVT17的两相发酵系统。结果表明,在培养24小时后加入5%（v/v）橄榄油时,生育三烯酚的产量最高,达到76.6 mg/L,其中56.12%的产物分泌到有机相中。为了提高生育三烯酚的转运效率,我们在菌株YVT17中分别过表达了内源性PDR转运蛋白及其转录激活因子,筛选获得了能够促进生育三烯酚分泌的内源性PDR转运蛋白。以橄榄油为原位萃取剂对同时过表达内源性PDR转运蛋白PDR11和YOL075C的菌株进行两相发酵,将生育三烯酚产率提高到25.57 mg/g DCW,其中73.66%分泌到有机相中。在前面的工作中已经实现了混合结构生育三烯酚的高效合成,但是在实际应用过程中对于单一结构生育三烯酚有更高的需求。δ-生育三烯酚具有保护原代神经元细胞免受谷氨酸中毒和降低胆固醇水平的功能,并且还是一种有效的放射性保护剂和缓解剂,因此具有广泛的应用价值。由于δ-生育三烯酚在植物中的含量普遍较低,且难以与其他结构的生育三烯酚进行分离,纯化成本高,构建选择性生产δ-生育三烯酚的微生物细胞工厂是一种有前途的替代途径。为了构建高产单一结构δ-生育三烯酚的酵母工程菌株,首先检验了不同底盘对生育三烯酚异源合成的影响,分别在酿酒酵母B Y4741、CEN.PK2-1C、CEN.PK2-1D以及解脂耶氏酵母Polf中构建了 δ-生育三烯酚的生物合成途径。首次在解脂耶氏酵母中实现了生育三烯酚的合成,δ-生育三烯酚产量为0.67 mg/L。与其他三种酵母相比,酿酒酵母BY4741的δ-生育三烯酚产量最高,达到7.75 mg/L。这个结果说明酿酒酵母BY4741更适合作为生育三烯酚生产的底盘,这也突出了筛选合适的宿主菌株对于萜类化合物生物合成的重要性。为了提高酿酒酵母BY4741的δ-生育三烯酚产量,利用途径模块化工程思想对途径进行了优化。首先对莽草酸途径模块进行了强化,通过消除芳香族氨基酸的反馈抑制和下调竞争途径来加强尿黑酸供应,使δ-生育三烯酚达到11.02 mg/L,其直接前体MGGBQ的积累量达到45.40mg/L。同时,对甲羟戊酸（MVA）途径模块进行强化,通过敲除低氧抑制因子编码基因ROX1解除MVA途径限制,增加CrtE03M拷贝数增强GGPP供应,过表达线粒体NADH激酶POS5提高辅因子供应以及敲除远端调控因子编码基因DOS2等策略提高MVA途径代谢通量。在此基础上,为了重建代谢流平衡,逐级增加下游关键限速酶TC与HPT的基因拷贝数使之匹配上游通量,最终菌株YBVT15的δ-生育三烯酚产量达到73.45 mg/L。考虑到环糊精作为包合剂对于疏水性产物溶解度的提高作用,在培养过程中添加2-羟丙基-β-环糊精（30 mM）,结合多向耐药转录因子PDR1的过表达,使δ-生育三烯酚的摇瓶产量达到243.57 mg/L（57.72 mg/g DCW）,其中9.99%分泌到培养基中。该过程实现了单一结构生育三烯酚的高效合成。本研究为维生素E重要成分生育三烯酚的发酵生产提供了具有潜力的菌株,同时这项研究也为其他疏水性萜类化合物的胞外分泌提供了方法借鉴。