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马铃薯是世界第四大粮食作物,在我国粮食、蔬菜、饲料和加工原料生产上占有重要地位。马铃薯因罹病毒病而引起的品种退化常导致产量和品质严重下降,一直是生产上的主要障碍之一。通过茎尖分生组织培养脱除病毒自上世纪70年代以来在马铃薯上推广应用,种薯生产技术随着生物技术的发展不断改进。马铃薯试管块茎是在组织培养条件下,诱导试管苗腋芽所形成的变态茎,在遗传稳定性、植物学、生理生化特性上与常规块茎无异,因此,其在种薯生产上的应用前景引起了国内外科学界广泛重视。但试管块茎的形成机理尚不清楚,导致生产效率不高,应用困难。本研究旨在不同的诱导条件下,研究块茎形成过程中植株内源激素的变化状况与块茎形成相关基因的表达模式,探索块茎形成的调控机理,为试管块茎生产提供理论和技术基础,所取得的主要研究结果如下: 1.通过培养中不同的光照长度、培养基不同的外源生长物质和蔗糖浓度处理,研究了普遍认为与块茎形成有关的内源GA3(赤霉素)、ABA(脱落酸)和JA(茉莉酸)的动态变化。结果表明,试管块茎形成与植株内源GA3和ABA的含量没有直接联系,而与GA3/ABA的比值有关。GA3和ABA均参与了块茎形成,并在不同的时期分别担负着不同的调节功能。只有当GA3/ABA比值达到一定范围时(本研究为1.1-1.3)才能获得较高的试管块茎诱导频率。在本研究较优的处理中,试管块茎诱导频率达到了2.3个/株,高于其它报道2倍左右。与GA3和ABA不同,块茎形成时均伴随着JA含量的迅速升高,证明JA是块茎形成的直接诱导物质。 2.在不同诱导处理条件下,在有块茎形成的处理中植株的总RNA含量在块茎形成时表现上升,说明块茎形成与新的基因表达有关。进一步采用mRNA差异显示分析表明,块茎形成过程中,除了有新的基因表达开启外,还有一些基因表达关闭,同时还伴随着许多基因的表达强度增强,证明块茎形态建成是一系列基因协同作用的结果。 3.Patatin基因与块茎形成具有直接关系。有块茎形成的处理,在凡能形成块茎的部位(匍匐茎、腋芽)于块茎形成时均有patatin基因的表达。试验结果还证明,该基因的表达受高浓度蔗糖的诱导,光照在表达诱导中存在着间接调节的作用机制。块茎形成只与patatin基因的表达有关,而与表达丰度没有直接联系,说明patatin基因除了有块茎诱导功能外,可能还担负有其它的植物生理功能。 4.试管块茎具有与常规块茎相同的组织结构,其中环髓薄壁细胞组织在整个块茎发育过程中一直占块茎的60%以上,对块茎大小起决定作用。在块茎发育过程中,块茎的细胞分裂和细胞膨大与块茎大小具有显著的幂函数关系(Y=aWb),其中细胞分裂速度一直高于细胞膨大的速度,说明细胞分裂对块茎生长更为重要。研究表明块茎形成与块茎生长分属两个独立的诱导调控系统,但在适宜的块茎形成诱导条件下,也可以获得理想的块茎大小。 5.在适宜的Patatin基因表达的诱导条件下,植株内源激素如GA3和ABA的平衡状态和JA的含量均处于块茎形成的适宜范围,说明Patatin基因与其它块茎形成相关基因的表达调控机制相同。在此基础上,本研究建立了在8%蔗糖浓度基础上、以光照为主要调控因素的试管块茎生产技术体系,解决了所使用品种间块茎诱导差异的问题,使每平方米生长室年试管块茎生产率达到20万个左右,为试管块茎的产业化生产打下了基础。