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研究目的:运用糖蛋白质组学结合糖组学的研究方法,对不同恶性程度的肝癌患者血清蛋白质进行研究,结合蛋白水平及糖水平来探究肝癌转移相关的分子标志及其机制。研究背景:蛋白质组学从整体角度对生物体动态变化的蛋白组成成分、表达水平、修饰状态、相互作用等进行结构及功能研究。蛋白质的浓度及翻译后修饰状态、亚细胞定位等是生物体调节内部功能的重要渠道,因此通过进行与疾病发生相关的蛋白质组的比较定量及其修饰状态的研究,能够为疾病的发生发展机理提供重要信息。蛋白质组学在诊断学中的应用,是基于血浆蛋白质中含有大量具有研究价值的低分子蛋白质,且对于复杂疾病如癌症,多分子组合诊断相对于单一分子可能具有更好的鉴别诊断能力[1]。近年来糖组学及糖蛋白质组学在癌症方面的研究也日益兴起,蛋白质通过调节不同的翻译后修饰对蛋白质的活性和功能进行精细调控,大量研究表明蛋白质糖基化修饰在肿瘤的发生及侵袭转移进程中会发生改变并有相应的功能性作用[2-5]。据报道,肝癌的诊断标志物扁豆凝集素LCA结合型甲胎蛋白（AFP-L3）相对于甲胎蛋白（AFP）其诊断灵敏度可以由原来的30.9%提高到75%,特异性从63%提高到90%以上[6-8]。尤其是AFP阴性肝癌病人的诊断。因此通过蛋白质组学结合近年来兴起的糖组学研究策略可以使我们对癌症及其转移机制有更加全面的理解。肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma,HCC）在全世界肿瘤发病率居第五位,死亡率第三位,每年全世界新发病人数超过500,000例[9],是我国和亚洲地区常见的恶性肿瘤。目前,一些常用的肿瘤生物学特征指标,如甲胎蛋白（AFP）、肿瘤大小、血管侵犯等对准确诊断、预测肝癌及其恶性程度有一定的局限性。目前与肝癌发生及治疗相关的蛋白质组学研究日益增多[10-12],但关于肝癌转移方面的临床蛋白质组学研究尚缺乏,尤其是在糖组学方面的研究。转移是影响肿瘤患者生存的首要因素,有人将攻克“癌转移”作为本世纪生命科学迫切需要解决的重大问题之一。本课题运用糖蛋白组学结合糖组学的研究方法,对不同恶性程度的肝癌患者血清糖蛋白进行研究,结合蛋白水平及糖蛋白聚糖水平来筛选和鉴定肝癌转移相关的分子标志物,并探索其机制。第一部分基于凝集素芯片的转移、非转移性肝癌血清糖蛋白聚糖谱比较和特征性聚糖的筛选方法:收集肝癌患者血清,根据2002 UICC TNM分期标准进行分期,肝癌TNMⅠ-Ⅱ18例（非转移复发组）,肝癌TNMⅢ-Ⅳ18例（转移组）,各分三组,每6例混合。血清蛋白经高丰度蛋白去除柱ProteoExtractTM Albumin/IgG Removal kit处理后用2-D Quant Kit检测收集到的蛋白浓度。Cy5染料标记低丰度蛋白。采用凝集素芯片技术,筛查人肝癌转移相关血清糖蛋白凝集素亲和谱,该芯片包含了13种肿瘤相关凝集素,最后采用多重凝集素亲和印迹的方法验证芯片得到的差异凝集素。结果:凝集素芯片和凝集素印迹结果一致表明,与非转移人肝癌血清相比,转移性肝癌血清糖蛋白对WGA、SNA、PHAE、DSA的亲和作用增强（P<0.05）。表明该四类凝集素亲和糖蛋白聚糖的增加。结论:转移性肝癌血清糖蛋白出现了增多的唾液酸、N-乙酰葡萄糖胺（GlcNAc）、平分型GlcNAc及多天线、偏二天线糖链结构,血清糖蛋白聚糖链的变化与肿瘤侵袭和转移密切相关。第二部分转移和非转移肝癌病人血清WGA亲和型糖蛋白定量蛋白质组学分析方法:收集肝癌患者血清,根据2002 UICC TNM分期标准进行分期,肝癌TNMⅠ-Ⅱ1 8例（非转移组）,肝癌TNMⅢ-Ⅳ18例（转移组）,每18例混合。设对照组健康人群血清27例作为一个混合样本。选用（GlcNAc）n,α2,3/6/8连接的唾液酸亲和型的麦胚凝集素WGA通过固相亲和层析富集糖蛋白,进而应用iTRAQ联合液相色谱串联质谱（liquid chromatography-tandem Mass spectrometry,LC-MS/MS）技术,对转移、非转移血清WGA亲和型糖蛋白进行定量比较蛋白质组学研究,筛查与肝癌恶性程度相关的差异糖蛋白。并采用蛋白印迹方法进行了蛋白水平的验证。结果:相对于非转移组肝癌,iTRAQ联合液相色谱串联质谱（liquid chromatography一tandem Mass spectrometry,LC一MS/MS）技术共鉴定出转移组肝癌中上调1.5倍以上的差异糖蛋白有9个,下调0.5倍以上的6个。其中差异蛋白SERPINA1在蛋白水平得到了验证,表明蛋白水平在转移组血清中一致上调。结论:本研究筛查出一系列肝癌转移相关糖蛋白,可能作为潜在的肝癌恶性程度和不良预后的新指标及治疗靶点,为临床筛选肝癌侵袭及转移相关的糖标记提供了重要参考。创新点1.已有的对肝癌转移方面的研究多数采用的是不同转移潜能的细胞株及动物模型,而本研究根据2002 UICC TNM分期标准,将肝癌分为非转移组（TNMⅠ-Ⅱ1 8例）,转移组（TNMⅢ-Ⅳ18例）,国内外首次对转移和不伴转移的人肝癌血清糖蛋白进行了研究。2.应用凝集素芯片技术筛查出了WGA, SNA, PHA-E, DSA四种肝癌转移相关差异凝集素。3.通过WGA凝集素固相亲和层析、应用iTRAQ联合液相色谱串联质谱（liquid chromatography-tandem Mass spectrometry,LC一MS/MS）技术,筛查出差异表达的蛋白共15个,表达上调1.5倍以上的有9个,下调0.5倍以上的有6个。其中SERPINA1和肝癌转移的相关性为首次报道。潜在应用价值凝集素相关糖链研究技术是可行的较新的糖蛋白质组学研究策略之一,本研究筛查出的一系列转移相关的糖蛋白,可能作为潜在的转移预测新指标和治疗新靶点,并且为肝癌转移相关糖标记的研究奠定了良好基础。