RhoA蛋白作为一种重要的小GTP酶蛋白,在细胞内受到多种蛋白精细且复杂的调控,使其在GTP结合活性状态及GDP结合非活性状态之间相互转换,从而在细胞骨架重构、细胞侵袭迁移等诸多方面发挥着重要的分子开关调控作用。最近研究表明,RhoA基因在多种恶性疾病中会发生较高频率的基因突变,但是由于RhoA蛋白结构的高度可变性、功能调控的复杂性,导致RhoA突变体功能研究进展迟缓,极大限制了RhoA突变相关疾病治疗手段的开发。除突变以外,RhoA在多种恶性实体肿瘤中亦存在异常高表达的现象,能够影响疾病进程。由于RhoA主要通过突变及异常表达参与疾病进程,因此开发出靶向突变体或野生型RhoA蛋白的特异性调节分子具有重要的意义。然而由于RhoA与底物GDP/GTP具有超强的亲和力,并且除了底物口袋外缺乏其他可供小分子结合的口袋,使其成为“难靶蛋白”,极大限制了该蛋白靶向性调节分子的开发。目前,RhoA的疾病相关突变体的功能研究以及该蛋白靶向性调节分子的开发已成为领域内的难点问题,亟需使用新的策略对该科学问题进行深入研究。本研究首先以成人T细胞淋巴瘤/白血病（ATL）中最常见的RhoAC16R突变为研究对象,对RhoA的Cys16位点突变的功能及作用机制进行深入研究。一系列生物化学、细胞生物学实验结果表明,RhoAC16R突变在分子及细胞水平上均可以增强RhoA与多种鸟嘌呤核苷酸交换因子（GEF）的相互作用,加快GEF催化下的RhoA底物交换速率;但同时也会降低RhoA与底物GDP/GTP亲和力,削弱RhoA与下游不同效应蛋白的直接相互作用;其最终综合性影响结果是RhoA下游信号通路被阻断,表明RhoAC16R是失活性突变。为了揭示RhoA C16R突变的作用机制,本研究又解析出RhoAC16R突变体晶体结构以及另外两种常见于ATL的RhoA突变体RhoAC16L和RhoAC16G的晶体结构,结果发现包括C16R在内的三种Cys16位点突变均可通过变构效应引起远端的功能性调控区域switch I和switch II发生较大构象变化,并增大底物结合口袋以及破坏与底物GDP/GTP之间的氢键作用,从而在结构上揭示了RhoAC16R突变对RhoA生物学功能的失活性影响作用机制。此外,RhoA蛋白的活性部位易受变构效应影响的现象表明,RhoA靶向调节分子的开发可不拘泥于靶向RhoA底物口袋,位于RhoA活性部位以外的具有变构调控性质的位点亦可作为靶点,从而扩展了RhoA靶向调节分子开发渠道。基于RhoAC16R分子作用机制研究中所发现的RhoA活性位点易受远端结构变化影响的特点,针对RhoA缺乏“可靶向性”口袋的难点问题,本研究又对RhoAC16R突变体蛋白及野生型RhoA蛋白进行了分子动力学模拟（MD）研究,去寻找RhoA蛋白中潜在的小分子化合物结合口袋。最终在野生型RhoA的结构动态变化过程中捕捉到一个空间足够容纳小分子化合物的口袋,该口袋位于Cys107周围,远离RhoA活性位点。随后,通过对该位点的基于共价对接的虚拟筛选,以及对所得到的化合物的活性筛选,得到了可在体外有效抑制野生型RhoA活性的苗头化合物DC-Rhoin。通过对RhoA蛋白与DC-Rhoin复合物晶体结构的解析以及NMR、质谱、生化实验分析,证实DC-Rhoin为首个RhoA变构抑制剂,该化合物可特异性共价结合在RhoA的Cys107上,稳定MD中瞬时出现的变构口袋“CLoc K”,并通过变构调控引起远端67-74位残基发生较大构象变化,从而选择性地破坏了RhoA与GEF、鸟嘌呤核苷酸解离抑制剂（GDI）的相互作用,而基本不影响RhoA与GTPase激活蛋白（GAP）的相互作用。不仅如此,DC-Rhoin通过与Rho亚家族内保守的Cys107结合,实现了该化合物对Rho亚家族的特异选择性。为了提高变构抑制剂的选择性及活性,本研究对DC-Rhoin进行了化学改造。经过体外及细胞内活性筛选,本研究得到了细胞活性最佳的先导化合物DC-Rhoin04,该化合物在5μmol/L浓度左右可显著抑制三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231中RhoA蛋白的下游信号通路,从而对肿瘤细胞的细胞骨架形成、侵袭、迁移及增殖产生抑制作用。随后,本研究又通过基因敲减及回补实验检验了DC-Rhoin04在细胞内的在靶性,结果发现,在RhoA敲减以及回补不与化合物结合的RhoAC107A突变体的MDA-MB-231细胞中,DC-Rhoin04丧失了对细胞迁移侵袭的抑制作用,表明细胞内RhoA的Cys107为DC-Rhoin04的作用位点,化合物DC-Rhoin04可通过特异性与RhoA蛋白Cys107相结合,阻断RhoA蛋白下游信号通路,从而发挥出抑制肿瘤细胞迁移、侵袭及增殖的作用。综上所述,本研究着眼于RhoA蛋白现有的研究难点,综合运用结构生物学、生物化学、细胞生物学等多学科技术手段,系统阐明了疾病中高发的RhoAC16R突变对RhoA功能的影响作用及其作用机制,认识到变构效应对RhoA结构与功能的重要影响作用,并在此启发下,在RhoA蛋白表面上找到首个变构调控口袋,开发出第一个靶向“难靶蛋白”RhoA的共价变构抑制剂。这些研究为疾病相关的RhoA突变的机制研究、靶向RhoA的创新药物研发提供了新思路、新方法,为RhoA相关疾病的治疗手段的开发奠定了基础。